高脂饮食诱导肥胖小鼠下丘脑神经细胞超微结构的观察.pdf
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1、第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ,文章编号:()高脂饮食诱导肥胖小鼠下丘脑神经细胞超微结构的观察钟霄毓,陆 敏,袁 琳,胡 娜,林 敏,姜 逸,陆 雄(上海中医药大学 科技实验中心 细胞生物与组织病理学实验室,上海)摘 要 目的:通过透射电子显微镜以及免疫组化染色观察高脂饮食诱导肥胖小鼠下丘脑中各类神经细胞超微结构以及数量的改变的变化。方法:将 小鼠随机分为正常组和高脂组,正常组给予常规饲料,高脂组给予高脂饲料,周后心脏灌流固定,处死动物取下丘脑,进行透射电镜和免疫组化制备观察。结果:和正常组相比,高脂组小鼠下丘脑神经元数量变化不明显,体积缩小,电子密度加深;细胞核深染,异染色质
2、增加,核周粗面内质网和游离核糖体减少,线粒体肿胀,可见较多脂褐素沉积。和正常组相比,高脂组小鼠下丘脑星形胶质细胞数量明显增多,部分星形胶质细胞体积变小,胞质电子密度增加,部分细胞胞浆水肿。和正常组相比,高脂组小鼠下丘脑小胶质细胞数量显著增多,且靠近神经元,部分小胶质细胞内可见溶酶体增多。和正常组相比,高脂组小鼠下丘脑少突胶质细胞超微结构的形态未见明显的改变。结论:长期高脂饮食,会导致小鼠下丘脑各类神经细胞在数量和形态上发生改变。关键词 高脂饮食;下丘脑;神经细胞;透射电子显微镜;超微结构中图分类号:;文献标识码:收稿日期:;修订日期:基金项目:上海中医药大学预算内项目()作者简介:钟霄毓(),
3、男(汉族),上海人,在读研究生:通讯作者:陆雄(),男(汉族),上海人,研究员:世纪以来,全球有超过 亿人超重或肥胖。高脂饮食与肥胖症发病率的增加密切相关,并与代谢综合征的发病有关,长期食用高脂饮食()会促进外周组织(如脂肪组织、肝脏)和中枢神经系统的低度炎症。肥胖也与一系列病理反应有关,这些反应发生于下丘脑等参与能量稳态的区域,包括炎症激活和内质网应激增加以及反应性胶质增生等,其特征是局部星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。脑神经组织主要由神经元和神经胶质细胞组成,透射电子显微镜是观察和鉴定神经组织超微结构的重要手段,然而,目前有关高脂饮食引起的下丘脑神经细胞超微结构病理变化的报道较少,本研究旨
4、在通过透射电子显微镜对高脂饮食引起的下丘脑各类神经细胞超微结构的病理改变进行观察与描述。材料与方法 实验动物 雄性小鼠 只,周龄,体重(),来源于上海斯莱克实验动物有限公司,生产许可证:(沪),于上海中医药大学实验动物中心二楼 级实验室内饲养,温度:(),相对湿度:(),光照 ,给与自由饮食饮水,并按实验动物使用的 原则给予人道关怀,动物伦理号:。随机分为正常()组和高脂饮食()组,每组 只。正常组给与常规饲料(,中国江苏协同医药生物工程有限公司),脂肪供能比为;高 脂 组 给 与 高 脂 饲 料(,美 国 公司),脂肪供能比为。高脂饮食喂养 周,实验末,经心脏灌流后,处死动物,取出下丘脑。试
5、剂与仪器 十二水合磷酸氢二钠,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:;二水合磷酸二氢钠,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:;蔗糖,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:;舒泰 (),购自,批号:;戊二醛溶液,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:;锇酸,购自 公司,批号:电子显微学报 第 卷;无水乙醇,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:;丙酮,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:;环氧树脂,购自上海树脂厂;十二烯基丁二酸酐(),购自 ,批号:;,三(二甲胺基甲基)苯酚(),购自,批号:;邻苯二甲酸二丁酯(),购自国药集团化学试剂有限公司,批号:;醋 酸 双 氧 铀,购 自,货 号:;硝酸铅,购自
6、国药集团化学试剂有限公司,批号:;二水合柠檬酸三钠,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:;氢氧化钠,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:;二甲苯,购 自 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司,批 号:;多 聚 甲 醛 购 自,货 号:;购自,货号:;牛血清白蛋白()购自,货号:;购自,货号:;购自,货号:;购自,货号:;购 自,货 号:;购自,货号:;()购自,货号:;购 自,货 号:;购 自,货 号:;购自,货号:。冰冻切片机(美国 公 司,型 号:);鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司,型号:);超薄切片机(德国 公司,型号:);透射电子显微镜(美国 公司,型号:);正置荧光显
7、微镜(德国 公司,型号:)。实验方法 透射电镜样品制备 实验末小鼠禁食 ,处死前腹腔注射舒泰(),麻醉后,打开胸腔,心脏灌流 缓冲液,之后灌流 多聚甲醛,取出整脑,一半放入 多聚甲醛用于免疫组化染色;另一半分离下丘脑,放入装有 戊二醛的小瓶中,于 冰 箱 中 固 定 以 上。取 出 下 丘 脑,经 缓冲液漂洗后,转移至 锇酸固定液中,于 冰箱中固定 以上。漂洗后在 条件下乙醇梯度脱水。室温下 丙酮 (次),纯丙酮包埋液(),纯包埋液 烘箱 (次)。将下丘脑组织至装有包埋液的包埋板中,烘箱过夜,之后转移到 烘箱。聚合后将下丘脑组织周围多余的环氧树脂用刀片去除,然后进行超薄切片,厚度为 ,醋酸双氧
8、铀与柠檬酸铅双染色 ,蒸馏水清洗后自然晾干,于透射电镜下观察。免疫组化 取出 多聚甲醛保存的脑组织,蔗糖脱水,在冰冻切片机上 切片。处理脑组织切片 ,清洗后加入 室温震荡 ,封闭 后加入按一定比例稀 释 的 一 抗,过 夜,包 括 (,),(,)和(,);清洗后加入相应二抗 (,);()(,);(,)在 室 温 下 轻 轻 摇 动 孵 育 ,三 抗(,)孵育 ,洗涤后,(,)染色,铺片,晾干后酒精梯度脱水,二甲苯透明,封片,观察。每组 只小鼠,每只取 张脑组织切片,显微镜下观察,在 倍视野下,拍摄每张脑组织切片下丘脑随机区域各 张,计数阳性细胞的数目。统计学分析 通过 软件进行处理,数据以 表
9、示,组间独立样本比较采用 检验。表示差异具有统计学意义。结果 神经元 电镜下观察,正常组小鼠下丘脑神经元细胞核较大,多为圆形,异染色质少,主要为常染色质,核仁清晰,大而明显。核周细胞质粗面内质网和游离核糖体丰富(图)。高脂组大部分神经元细胞体积缩小,电子密度加深;细胞核深染,异染色质增加,核周粗面内质网和游离核糖体减少,部分线粒体肿胀,可见较多脂褐素沉积(图,)。免疫组化结果显示,与正常组相比,高脂组小鼠下丘脑内神经元数量上没有明显变化(图)。星形胶质细胞 电镜下观察,正常组小鼠下丘脑星形胶质细胞的体积比神经元小,通过终足附着于毛细血管表 第 期钟霄毓等:高脂饮食诱导肥胖小鼠下丘脑神经细胞超微
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