二十二碳六烯酸对奶山羊乳腺上皮细胞转录调控机理研究.pdf
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1、动物营养学报,():二十二碳六烯酸对奶山羊乳腺上皮细胞转录调控机理研究雷 琼 郭宇康 张佳惠 张 富 刘维巍 刘庆华(福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福州)摘 要:本试验旨在研究二十二碳六烯酸()对奶山羊乳腺上皮细胞()转录调控机理。试验使用不同浓度的(、和 )对 进行处理,并测定细胞活力,然后利用转录组测序()技术对 作用的 进行测序,获得并分析相关基因表达。结果表明:)与空白对照组(无 处理)相比,低浓度()对各时间点 细胞活力无明显抑制作用;当 浓度高于 时,细胞活力出现明显下降。在不同时间点,时各浓度 处理 细 胞 活 力 高 于 其 他 时 间 点。因 此,选 择 处 理 时
2、间 为 、浓 度 为 用于后续试验。)构建 在 中作用的 文库,获得的碱基质量值 的碱基所占百分比()和碱基质量值 的碱基所占百分比()均在 以上,鸟嘌呤和胞嘧啶()占比为,各个组的比对效率为 ,表明转录组信息质量较高。)以 差异倍数()且 为筛选标准,共筛选出 个显著差异表达基因(),其中 个基因表达上调,个基因表达下调。)基因本体论()富集分析发现,主要富集在铁离子结合、聚合细胞骨架纤维、中间丝状体细胞骨架和中间丝状体中,并参与 家族鸟苷三磷酸酶()、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()和 等信号通路的信号转导。)京都基因和基因组百科全书()富集分析发现,显著富集到视黄醇代谢、谷胱甘肽代谢、亚油酸代
3、谢、化学致癌、药物代谢细胞色素 和过氧化物酶体增殖物激活受体()信号通路。由此可知,在 的免疫、细胞骨架构建、抗炎、抗癌及代谢等相关通路中具有明显作用,其中亚油酸代谢、信号通路能够在脂代谢方面发挥作用。关键词:二十二碳六烯酸;奶山羊;乳腺上皮细胞;转录组测序中图分类号:文献标识码:文章编号:()收稿日期:基金项目:福建农林大学项目(,);福建省 年中央引导地方科技发展资金()作者简介:雷 琼(),女,河南方城人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。:通信作者:刘庆华,副教授,硕士生导师,:二 十 二 碳 六 烯 酸(,)是一种具有很强生物学活性的多不饱和脂肪酸(,),具 有 抗癌、抗肿瘤
4、、抗炎以及改善脑细胞和视力发育等生物功能,对预防和缓解心血管疾病也有积极影响。可通过调节前列腺素作用和降低血液中甘油三酯()的含量,减少人类疾病的发生。人体自身合成 有 限,一 般 通 过 饮 食 获 取 所 需。世界卫生组织()和美国国立卫生研究院()将健康成年人每天的 摄入量设定为 ,但目前许多国家和地区大多数人口的实际 摄入量远低于该水平。动 物 营 养 学 报 卷 近年来,乳腺上皮细胞(,)被作为一种理想的试验模型用来研究乳腺泌乳机制,并能够验证乳腺组织中基因表达载体构建是否有效。郭丹利用构建过表达载体及合成干扰 等方法,研究 和程序性细胞死亡因子()对奶山羊乳腺上皮细胞(,)增殖、凋
5、亡和泌乳的调控作用;潘坛通过克隆、构建过表达载体及干扰,运用 和 技术 探 究 假 激 酶 ()基 因 对 乳脂代谢调控的机制,为奶山羊乳品质的提高奠定了理论依据。转录组测序()技术旨在研究解释基因组关键功能的输出,以确定特定条件或疾病状态下细胞或组织基因表达的变化。近年来,技术不仅有助于构建基因文库,还有助于我们更好地理解反刍动物发育、适应性进化、宿主免疫反应和应激反应等各项生物过程。本试验采用 技术,对相关通路及 基 因 进 行 分 析 研 究,以 期 阐 明 对 生物组学的影响,为奶山羊的营养研究提供参考。材料与方法 试验材料 本试验采用购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司的泌乳盛期永
6、生化,传代培养 代后发现,细胞密集生长状态下呈典型的鹅卵石或铺路石样,符合 细胞形态特征(图);纯品 由厦门汇盛生物有限公司提供,其中 纯度为。图 细胞形态 ()试验方法 细胞活力的测定 以 原代上皮细胞基础培养基、胎牛血清()、上皮细胞添加剂和 青链霉素混合液作为细胞培养试剂 原代上皮细胞基础培养基、原代上皮细胞培养添加剂购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司,青链霉素混合液购自苏州新赛美生物科技有限公司。将 接种于 孔板,待细胞融合度至 左右时,更换含有不同浓度 的培养基,添加组的 浓度分别为、和 ,并设置空白对照组(无 处理),每组 个重复;分别孵育、和 ,孵育后更换新鲜培养基,去除药物
7、影响,每孔加入 溶液,将培养板置于培养箱内孵育 。用酶标仪(公司,美国)测定 处的吸光度()值以计算细胞活力。提取及质量检验 按照 总 提取试剂盒提取细胞总,将提取后的总 进行质检,使用分光光度计(公司,德国)测定总 在 和 处的 值以确定是否符合后续试验要求,并通过琼脂糖凝胶电泳试验确认 的完整性。然后 使 用 检 测 试 剂 盒(,上海迈跟生物科技有限公司)对 进行 定量分析。利用 通 过 系 统 对 完整值()及 质量峰图进行分析。文库构建及检测 样品质控达到要求后,进行 文库的构建与检测。使用 磁珠分离()富集 中的,然后添加 ,将 打断成小片段。使用随机 引物为模板反转录合成 第 链
8、,注入核糖核酸酶()及 聚合酶合成第 条链,使用 提取试剂盒,对生成的 片段进行纯化,继而加入 缓冲液洗涤 片段,对末端进行修复、加碱基 并连接测序接头。通过琼脂糖凝胶电泳在凝胶中提取目的片段,通过 纯化和富集 片段以构建最终的 文库。构建的 文库名称为:(对照组)、(试验组)。文库在 期雷 琼等:二十二碳六烯酸对奶山羊乳腺上皮细胞转录调控机理研究测序平台()上使用广州基迪奥生物科技有限公司的双末端技术进行测序。数据分析 测序数据质控 使用 软件对 进行质量评估,并 使 用 软 件 对 进 行 筛选,去除一些带接头、低质量的,对 再进行新一轮质控,得到 的数据信息。参考序列比对利用、软件对获得
9、的测序数据进行过滤,与山羊参考基因组()进行比对,获得各个位置的比对效率及位置序列,利用 分析软件将比对上的序列组装,并与山羊参考基因组注释信息比较,确定序列中已知基因和未知基因来源。基因表达水平分析 基因表达水平分析能够比较样品间基因表达的相关性,并筛选出差异表达基因(,)。通常用每千碱基每百万读取(,)值作为基因表达水平的衡量指标,计算得到的基因表达水平可直接用于比较不同样品间的。利用比对到参考基因组和参考基因的 统计基因表达水平,然后对表达的基因进行注释。筛选 指样品间或同一样品经不同处理后,上调和下调表达基因的汇总。通常从差异倍数(,)及显著水平两方面对 进行评定,再对 进行筛选,本研
10、究以 且 作为标准进行筛选并分析。的基因本体论(,)富集分析 数据库作为一个综合数据库,能够将转录本功能进行分类汇总。富集情况主要从 个方面确定,分别是生物学过程(,)、细胞组分(,)和分子功能(,)。对 进行注释并作 富集分析图,有助于更好理解 的分布情况及生物学功能。通过 富集分析可以找出富集 的 分类条目,寻 找 不 同 样 品 的 可能与哪些功能的改变相关。的 京 都 基 因 和 基 因 组 百 科 全 书(,)富集分析 不同基因能够在生物体中协同作用,参与到生物体代谢、信息传递和细胞过程等一系列信号通路中,数据库能够系统的对基因功能进行分析,并能够确定 在生物体或细胞中参与的信号转导
11、通路。为了了解基因的生物学功能、代谢途径等提供有利信息,富集分析可以通过超几何检验识别 中显著富集的代谢途径或者信号传导通路。实时荧光定量()验证 为验证 结果,本研究随机选取 个 利用 技术测定其在 中的相对表达量,并进行计算及差异性分析。数据统计分析 采用 对试验数据进行初步整理和统计,并采用 软件对各组数据进行单因素方差分析(),表示差异显著。结果与分析 对 细胞活力的影响 由图 可知,与空白对照组相比,低浓度()对各时间点 细胞活力无 明 显 抑 制 作 用;当浓 度 高 于 时,细胞活力出现明显下降。在 不 同 时 间 点,时 各 浓 度 处 理 细胞活力低于其他时间点,时各浓度 处
12、理 细胞活力高于其他时间点。因此,选 择 处 理 时 间 为、浓 度 为 用于后续试验。图 对 细胞活力的影响 动 物 营 养 学 报 卷 结果分析 质量分析 本试验提取到的测量样本的总 含量为 ,浓度为 ,值为,均在 以上,符合试验质检要求。对 进行琼脂糖凝胶电泳后,可以清晰地看到、和 电泳条带(图),表明 整体质量较高,可进行下一步试验。表示 标记,、和 表示对照组(无 处理)样本,、和 表示试 验 组(处理)样本。,(),()图 琼脂糖凝胶电泳图 测序质量分析 通过对 进行测序质控,得到 个样本的 的平均数量为 条,其碱基质量值 的碱基所占百分比()在 以上,碱基质量值的碱基所占百分比(
13、)在以上,鸟嘌呤和胞嘧啶()占比为 左右,均处于测序要求正常范围,能够达到后续分析要求。序列比对分析 以山羊参考基因组作为参考,对测序数据进行比对分析发现,各个组的比对效率为 ,表明所选基因组匹配度较高,满足进一步分析需要。序列比对分析结果表明,能够比对到多个位置的序列约占,有唯一比对位置的序列约占,未比对到参考序列上的序列数目平均值为,单个试验样品 与 具体比对到参考基因组的数据情况见表。基因表达水平分析 经测序,本试验共得到转录本 条,其中对照组样品分别有 、和 条有效转录本,试验组样品分别有 、和 条有效转录本。单个试验样品 和 的基因表达水平分析见表。为评估各组样品基因表达水平的差异,
14、根据 值的大小,将基因 表 达 水 平 分 为 个 等 级:极 低 表 达 基 因()、低表达基因()、中表 达 基 因()、高 表 达 基 因()和超高表达基因()。结果显示,在各组样品中,绝大多数基因属于低表达基因,高表达和超高表达基因分别约占和,根据 值的大小列出对照组和试验组表达水平前 的基因,如图 所示。表 序列比对到参考基因组的数据情况 项目对照组 ()试验组 ()()()()()()()()()()()()()()()()()期雷 琼等:二十二碳六烯酸对奶山羊乳腺上皮细胞转录调控机理研究续表 项目对照组 ()试验组 ()()()()():用户标识()去重后的 总数 ();:比对到
15、参考基因组上的序列总数 ;:在参考序列上有多个比对位置的序列数目 ;:在参考序列上有唯一比对位置的序列数目 ;:未比对到参考序列上的序列数目 ;和:序列两端分别定位到参考基因组上的序列数目 ;:比对到参考基因组上的正链序列数目 ;:比对到参考基因组上的负链序列数目 ;:整段比对到外显子的序列数目 ;:分段比对到 个外显子上的序列数目 。括号内的数值表示所占比例 。表 基因表达水平分析 间隔 对照组 ()试验组 ()有效转录本 极低表达基因 ()()()低表达基因 ()()()中表达基因 ()()()高表达基因 ()()()超高表达基因 ()()()括号内的数值表示所占比例。分析 本试验从 和显
16、著水平方面对 进行筛选,以 且 作为筛选 标准,共筛选出 个显著,其中 个基因表达上调,另 个基因表达下调。火山图见图。和 富集分析 功能注释 根据 功能富集的筛选标准(),下调 共富集到 个注释节点中,结果如图 所示,其中 个()参与到生物学过程,个()参与到细胞组分,个()参与到分子功能。在生物学过程类别中,较显著的 注释是肝配蛋白受体信号通路()(:)和表皮细胞分化()(:);在细胞组分类别中,较显著的 注释是角蛋白丝()(:)、中 间 丝 状 体()(:)和中间丝状体细胞骨架()(:);在分子功能类别中,较显著的 注释是肝配蛋白受体结合()(:)、谷胱甘肽转移酶活性()(:)和转移酶活
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