HPLC法测定白藜芦醇在大鼠肝微粒体体外代谢含量.pdf
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1、人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 4 期白藜芦醇渊resveratrol袁Res冤袁化学名3袁4袁5-三羟基二苯乙烯袁分子式为C14H12O3渊结构如图1冤袁相对分子质量为228.25袁 为白色针状晶体袁 易溶于甲醇尧乙醇尧丙酮等有机溶剂1袁是一种非黄酮类多酚物质袁植物在恶劣环境或受到霉菌感染等外界因素刺激时产生的一种植物抗毒素2-4袁存在于葡萄尧虎杖尧花生等植物和果实中5遥 Res 具有抗菌尧抗癌尧抗炎尧抗氧化尧抗衰老尧抗心血管疾病尧保肝尧免疫刺激尧抑制血小板聚集尧调节脂质代谢尧清除自由基及雌激素样等作用和功能6-10遥图 1 Res 的化学结构图关于Res 的药理作用
2、及机制已有大量文献研究报道袁而Res 的药物代谢动力学虽有相关的文献报道11,12袁但大部分是体内代谢研究遥 由于Res 在体内代谢迅速袁血药浓度远低于体外实验的有效浓度袁相关体内研究表明其生物利用度低袁不足以发挥相应的药理活性13,14遥 体外药物代谢可在短时间内得到大量的代谢产物袁同时还可避免体内因素的干扰袁观察酶对底物的代谢过程15遥 而体外代谢中袁已有越来越多的文献报道16,17运用肝微粒体体外温孵法来预测药物在体内的代谢及清除遥本文旨在建立HPLC 法测定白藜芦醇在大鼠肝微粒体中的体外代谢研究袁为后续Res 的体内代谢或药效学研究提供参考依据遥1仪器与材料1.1实验仪器Waters
3、高效液相色谱仪渊美国Waters 公司冤曰MQD-S3 型恒温振荡箱渊上海旻泉公司冤曰FA124C 型电子分析天平渊上海力辰邦西仪器有限公司袁d=0.0001g冤曰BK-180J 型超声波清洗机渊迈福渊山东冤科学仪器股份有限公司冤曰XH-C 型涡旋混合器渊金坛市国旺实验仪器厂冤曰DW-86L626 型超低温冰箱渊青岛海尔生物医疗股份有限公司冤曰DW-25L262 型医用低温保存箱渊青岛海尔特种电器有限公司冤曰HAC-I 型氮吹仪渊天津市恒奥科技发展有限公司冤遥1.2 试剂与试药Res 渊M17HB178543冤袁 购自源叶生物曰NADPH渊411U022冤袁购自索莱宝公司曰大鼠肝微粒体袁蛋白含
4、量20mg/mL渊M10011冤袁武汉普莱特生物有限公司曰色谱级甲醇渊207899冤和乙腈渊204127冤袁购于Fisher 公司遥2方法与结果2.1色谱条件色谱分离袁 采用依利特Hypersil ODS2 色谱柱渊4.6mm伊250mm袁5滋m冤曰以乙腈-水渊35颐65袁V颐V冤为流动相曰检测波长为306 nm曰流速为1.0 mL/min曰进样体积为20滋L遥2.2溶液的制备2.2.1对照品溶液精密称Res 对照品适量袁加甲醇溶解袁混匀袁制备成浓度为25滋mol/L 的对照品溶液袁备用遥2.2.2NADPH 溶液精密称取NADPH 粉末适量袁加PBS 溶解袁混匀袁制备成浓度为10mmol/L
5、 的溶液袁备用遥2.3 温孵条件总温孵体积500滋L 渊设3 个平行管冤袁 肝微粒体10滋L尧NADPH20滋L尧PBS 补至500滋L袁 先将上述按需加完后与Res 溶液一起置37益恒温振荡箱预孵育5min 后袁再向该体系加5滋L Res 溶液渊反应体系中醇终体积分数小于1%冤袁再置于37 益振荡箱开始反应代谢袁并计时遥2.4 样品处理HPLC 法测定白藜芦醇在大鼠肝微粒体体外代谢含量赵宁宁1袁魏文增2渊1.福建医科大学实验动物中心袁福州 350122曰2.福建省中医药科学院袁福州 350003冤摘要院目的建立HPLC 法测定白藜芦醇在大鼠肝微粒体体外代谢的方法遥 方法采用依利特Hypers
6、ilODS2 色谱柱(4.6mm伊250mm袁5滋m)进行分离袁以乙腈-水渊35颐65袁V颐V冤为流动相袁流速为1.0mL/min袁检测波长为306nm袁进样体积20 滋L遥 结果白藜芦醇在30012.5滋mol/L 范围内呈良好线性袁线性相关系数为0.9991袁平均回收率为98.78%袁相对标准偏差(RSD)小于9.13%遥结论结果表明该方法操作简单尧稳定可靠袁可满足实验要求遥关键词院高效液相色谱法曰白藜芦醇曰大鼠曰肝微粒体作者简介院赵宁宁袁女袁助理实验师袁硕士袁研究方向生物肽与生化药理遥DOI院10.19403/ki.1671-1521.2023.园4.01135人参研究GINSENG R
7、ESEARCH2023 年第 4 期2.5.2线性关系试验在灭活体系渊大鼠肝微粒体经100益加热10min灭活冤中加入Res 标准品溶液袁最终浓度为300尧200尧100尧50尧25 和12.5 滋mol/L袁按野2.3 和2.4冶项下袁采用野2.1冶项下色谱条件袁依次进样分析袁以峰面积为纵坐标渊Y冤袁Res 浓度为横坐标渊X冤袁进行线性回归遥得到回归方程为Y=46660X-228300渊r=0.9991冤袁表明Res浓度在300耀12.5 滋mol/L 范围内线性关系良好遥2.5.3精密度试验加低尧 中尧 高浓度Res 溶液渊分别为25尧100 和300 滋mol/L冤袁按野2.3 和2.4
8、冶项下袁采用野2.1冶项下色谱条件袁考察日内精密度和连续3d 日间精密度袁记录各峰面积遥 计算得到Res 峰面积日内精密度的RSD 值分别为1.65%尧0.85%尧0.82%袁 连续3d 日间精密度的RSD 值均小于10.94%袁表明该仪器精密度良好遥2.5.4稳定性试验同野2.5.3冶项下袁在复溶后0尧2尧4尧6尧8 h 时进样分析袁 记录各峰面积遥 测得Res 峰面积RSD 值均小于10.54%袁表明8 h 内待测溶液具有良好的稳定性遥2.5.5重复性试验按野2.5.3冶项下袁平行制备3 份样品溶液袁记录各峰面积遥 测得Res 峰面积的RSD 值为10.33%袁表明该方法重复性良好遥2.5
9、.6回收率试验按野2.5.3冶项下袁记录各峰面积遥 计算得到Res 的高尧 中尧 低回收率分别为102.52%尧99.34%尧94.49%袁RSD 值分别为9.13%尧3.17%尧3.79%袁 表明该方法的准确度良好遥2.6样品含量测定按野2.3 和2.4冶项下袁反应6h袁采用野2.1冶项下色谱条件袁进样分析袁记录峰面积遥 计算Res 反应6h 后的代谢含量袁结果见表1遥孵育一定时间后袁 向体系加500滋L 的冰乙腈溶液终止反应袁 涡旋3min 后离心15min渊15000r/min冤袁取上清液袁挥干袁复溶袁过滤袁进样遥2.5方法学考察2.5.1系统适应性试验袁详见图2遥赵宁宁等院HPLC法测
10、定白藜芦醇在大鼠肝微粒体体外代谢含量图 2 Res 及其大鼠肝微粒体代谢的 HPLC 色谱图渊1.Res袁A.空白组渊无 Res冤袁B.Res 标准品溶液袁C.Res 孵育代谢组冤36人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 4 期表 1 Res 反应 6h 后的代谢含量结果渊n=3冤3结论与讨论3.1结论本文通过建立HPLC 测定Res 在大鼠肝微粒体体外代谢的方法袁 经实验得到HPLC 法的最佳条件为院 流动相为乙腈-水渊35颐65袁V颐V冤曰 检测波长为306nm曰流速为1.0mL/min曰进样体积为20滋L遥 本研究建立的HPLC 测定法方便尧快速尧分离度好尧灵敏度高尧稳
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