IL-33和Tim-3在儿童过敏性紫癜中的表达及临床意义.pdf
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1、*基金项目江苏省药学会项目(H202148)袁江苏省妇幼保健项目(F201650)*作者简介刘静袁女袁汉族袁生于 1988 年 1 月袁江苏省盐城市人袁硕士袁研究方向院儿科风湿免疫遥南 通 大 学 学 报 渊 医 学 版 冤Journal of Nantong University(Medical Sciences)2023 颐 43渊3冤DOI:10.16424/32-1807/r.2023.03.004引文格式院 刘静,周辉,秦劼,等.IL-33 和 Tim-3 在儿童过敏性紫癜中的表达及临床意义J.南通大学学报(医学版),2023,43(3)颐216-220.IL-33 和 Tim-3
2、在儿童过敏性紫癜中的表达及临床意义*刘静1*袁周辉2袁秦劼1袁于锦1(1南通大学第四附属医院袁江苏省盐城市第一人民医院儿科袁盐城 224001曰2南通大学附属医院儿科)摘要目的院探讨过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)患儿急性期 IL-33 与 T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobin domain and mucin domain protein-3,Tim-3)的表达及临床意义遥 方法院选取盐城市第一人民医院 2018 年 10 月要2019 年 10 月住院的 HSP 患儿(HSP 组)袁按临床症状分为单纯皮肤型(单纯组)
3、及混合型(混合组)袁各30 例袁并选取同期无过敏史尧自身免疫性疾病史及家族史健康体检者 20 例作为对照组遥 分别采用 ELISA尧实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)及 Western Blot 技术检测 3 组儿童血浆及外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)中 IL-33尧Tim-3 的表达水平袁并分析两者在血浆及 PBMC 中的相关性遥 结果院(1)单纯组尧混合组的血浆 IL-33尧Tim-3 水平均显著高于对照组(均 P约0.01)袁且混合组高于单纯组(P约0.05)遥HSP
4、 组血浆 IL-33 水平与 Tim-3水平呈正相关(r=0.824 7,P约0.05)遥(2)单纯组尧混合组 PBMC 中 IL-33尧Tim-3 mRNA 水平均显著高于对照组(均 P约0.01)袁且混合组高于单纯组(P约0.05)遥 HSP 组 PBMC 中 IL-33 mRNA 水平与 Tim-3 mRNA 水平呈正相关(r=0.847 9,P约0.05)遥(3)单纯组尧混合组 PBMC 中 Tim-3 蛋白水平均显著高于对照组(均 P约0.01)袁且混合组高于单纯组(P约0.05)遥 结论院IL-33尧Tim-3 参与了 HSP 的发病过程袁两者可能为 HSP 的早期诊断尧判断病情严
5、重程度提供线索遥关键词过敏性紫癜曰白细胞介素 33曰T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3曰儿童中图分类号R725文献标志码A文章编号1674-7887渊2023冤03-0216-05Expression and clinical significance of IL-33 and Tim-3 in children withHenoch-Schonlein purpura*LIU Jing1*,ZHOU Hui2,QIN Jie1,YU Jin1(1Department of Pediatrics,the Fourth Affiliated Hospital of Nantong Univer鄄s
6、ity,Yancheng First People忆s Hospital,Jiangsu Province,Yancheng 224001;2Department of Pediatrics,the Affiliated Hospitalof Nantong University)AbstractObjective:To investigate the expression and clinical significance of IL-33 and T cell immunoglobin domain andmucin domain protein-3(Tim-3)in children w
7、ith Henoch-Schonlein purpura(HSP).Methods:The HSP children(HSP group)who were hospitalized in Yancheng First People忆s Hospital from October 2018 to October 2019 were selected and classifiedaccording to clinical symptoms into simple skin type(simple group)and mixed type(mixed group),30 cases each gro
8、up,and 20health individuals with no history of allergies,autoimmune diseases and family history were selected as control group.Theexpression levels of IL-33 and Tim-3 in plasma and peripheral blood mononuclear cell(PBMC)of three groups of children weredetected by ELISA,real-time quantitative PCR(RT-
9、qPCR)and Western Blot respectively,and analyze the correlation betweenthe two in plasma and PBMC.Results:(1)The plasma levels of IL-33 and Tim-3 in both the simple and mixed groups weresignificantly higher than those in the control group(all P0.01),and the mixed group was higher than the simple grou
10、p(P0.05).There was a positive correlation between plasma IL-33 levels and Tim-3 levels in the HSP group(r=0.824 7,P0.05).(2)The levels of IL-33 and Tim-3 mRNA in PBMC of both the simple and mixed groups were significantly higher than thoseof the control group(all P0.01),and the mixed group was highe
11、r than the simple group(P0.05).There was a positive correla鄄tion between IL-33 mRNA level and Tim-3 mRNA level in PBMC of HSP group(r=0.847 9,P0.05).(3)The levels of Tim-3protein in PBMC of both the simple and mixed groups were significantly higher than those of the control group(all P0.01),and the
12、mixed group was higher than the simple group(P0.05).Conclusion:IL-33 and Tim-3 are involved in the pathogene鄄sis of HSP,both of which may provide clues for the early diagnosis and judgment of the severity of HSP.Key wordsHenoch-Schonlein purpura;interleukin-33;T cell immunoglobin domain and mucin do
13、main protein-3;child216窑窑过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是一种儿童时期常见的系统性血管炎性疾病。儿童HSP 的发病率为 13.5/10 万18/10 万1,且近几年发病有增多的趋势,难治性 HSP 也越来越多。HSP 的病因不明,研究2表明,HSP 患儿体内存在辅助性 T淋巴细胞(T-helper lymphocyte cell,Th 细胞)及 B 淋巴细胞活性增强,后者产生大量 IgA 免疫复合物,沉积在全身小血管壁而致血管炎。HSP 患者体内 Th 细胞亚群功能失调在其发病机制中起着非常重要的作用。有研究3提出,HSP 患儿体
14、内存在辅助性 T 细胞 1(T helper cell 1,Th1)/辅助性 T 细胞 2(T helper cell 2,Th2)失衡和 Th2 细胞过度活化。理论上,过度活化的Th2 细胞可促进细胞因子的分泌,然后,这些增加的细胞因子可诱导 B 细胞转化为浆细胞,促进免疫球蛋白的合成和释放,进而引起体液免疫异常4。IL-33是一种细胞因子,主要由活化的 T 细胞分泌,参与调节免疫反应和炎症反应。其为 IL-1 家族成员之一,在结构上与 IL-18 和 IL-1茁 关系最为密切。体外实验中5,增加小鼠体内 IL-33 水平,小鼠肺和循环血液中 IL-5 和 IL-13 水平升高,IgA 和
15、IgE 升高,肺部炎症加重。IL-33 具有促炎、抗炎双重作用,在多种血管炎性疾病和自身免疫性疾病中发挥着重要作用6。T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobindomain and mucin domain protein-3,Tim-3)是近年来新发现的一个基因家族,最初被发现表达在终末分化的 CD4+T 细胞(Th1)上。Tim-3 与其配体半乳凝集素-9(galectin-9,Gal-9)的结合可进一步诱导效应 T细胞的耗竭或凋亡,从而调节机体免疫耐受。Tim-3负性调节 Th1 细胞介导的免疫应答,参与多种免疫疾病的发生发展。本研究探讨 IL-33 及 T
16、im-3 在 HSP发病过程中的作用,进一步阐明 HSP 的发病机制。1对象与方法1.1研究对象选取盐城市第一人民医院自 2018年 10 月2019 年 10 月住院的新发 HSP 患儿 60 例(HSP 组),按临床症状分为单纯皮肤型(仅有皮疹表现,除外皮肤大面积出血坏死者)(单纯组)及混合型(除皮疹外尚伴有 2 种及以上症状,包括胃肠道症状、关节症状、肾脏症状)(混合组),各 30 例。单纯组中男 16 例,女 14 例,年龄 3.411.6 岁,平均(6.90依1.97)岁;混合组中男 15 例,女 15 例,年龄 3.111.4岁,平均(6.79依1.96)岁。纳入标准:(1)符合
17、HSP 诊断标准7;(2)首次发病;(3)入院时处于急性期;(4)未使用药物治疗。排除标准:(1)有过敏性疾病和其他自身免疫性疾病病史;(2)近 1 个月内使用过糖皮质激素及免疫抑制剂者。另选择同期儿童保健门诊体检者 20例为对照组,其中男 11 例,女 9 例,年龄 3.612 岁,平均(7.47依1.86)岁。否认过敏史、自身免疫性疾病史及家族史,采血前 2 周内无糖皮质激素及免疫调节剂使用史。3 组儿童的年龄分布及性别构成差异无统计学意义(P跃0.05)。研究过程遵循盐城市第一人民医院伦理委员会制定的伦理学标准(伦理号:2019-K009),并取得受试对象及监护人的知情同意。1.2检测方
18、法1.2.1ELISA 法检测血浆中 IL-33、Tim-3 的表达HSP 组入院后未使用药物治疗前,抽取外周静脉血约2 mL 置于肝素抗凝管,对照组同 HSP 组。参照 ELISA试剂盒(RB 公司,美国)说明书检测其血浆 IL-33、Tim-3 水平。1.2.2实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)中 IL-33、Tim-3 mRNA 的相对量分别取 HSP 组和对照组外周静脉血 5 mL,置于 EDTA 抗凝管中。采用密度梯度离心法分离提
19、取PBMC,经过相应的处理后冷冻备用。提取 PBMC 中总RNA,将 RNA 逆转录成 cDNA。反应体系如下:SYBRGreen 10 滋L,DNA 模板(100 ng/L)2 滋L,10 滋mol/L上、下游引物各 0.8 滋L,ddH2O 6 滋L,ROX ReferenceDye 0.4 滋L,放入 PCR 扩增仪,第一阶段 95 益 30 s,第二阶段(95 益 5 s寅60 益 30 s)共循环 40 次。PCR引物由上海生工设计并合成(表 1),内参为 GAPDH,对上述 PCR 扩增产物行实时定量检测,将得到的数据进行统计学处理。1.2.3Western Blot 技术检测 P
20、BMC 中 Tim-3 蛋白水平分别配制浓缩胶和分离胶,准备好电泳液,加入相应的蛋白后电泳,然后转膜。滴加羊抗人 Tim-3一抗(1颐400)(R驭D 公司,美国)及羊抗人 茁-actin 抗体(1颐800)(Santa Cruz 公司,美国)室温孵育 2 h,漂洗后滴加 HRP 标记的兔抗羊二抗(1颐1 000)(博士德公司,武汉),室温孵育后洗涤,显影分析。1.3统计学方法采用统计软件 SPSS 20.0 对所有表 1各基因 PCR 引物序列基因名称序列(5忆-3忆)IL-33PF:CTTTATGAAGCTCCGCTCTGGPR:GTTGACAGGCAGCGAGTATim-3PF:AATG
21、CCTATCTGCCCTGCTTCPR:CACCACGTTGCCACATTCAGAPDHPF:AATCCCATCACCATCTTCCAGGPR:AGTGGACTCCACGACGTACTCA刘静,等.IL-33 和 Tim-3 在儿童过敏性紫癜中的表达及临床意义217窑窑南 通 大 学 学 报(医 学 版)2023 颐 43渊3冤实验数据进行统计处理,符合正态分布的计量资料以x 軃 依s 表示,方差均齐;用方差分析进行组间比较;用 Pearson 进行两变量间相关性分析,双侧 琢=0.05为检验水准,P0.05 表示差异有统计学意义。2结果2.13 组血浆 IL-33尧Tim-3 水平比较单纯组
22、、混合组血浆 IL-33、Tim-3 水平均显著高于对照组,且混合组水平高于单纯组(P约0.05),见表 2。HSP 组血浆 IL-33 水平与 Tim-3 水平呈正相关(r=0.824 7,P约0.05),见图 1。2.23 组 PBMC 中 IL-33尧Tim-3 mRNA 水平比较单纯组、混合组 PBMC 中 IL-33、Tim-3 mRNA 相对值均显著高于对照组(均 P约0.01),且混合组高于单纯组(P约0.05),见表 3。HSP 患儿 PBMC 中 IL-33与 Tim-3 mRNA 水平呈正相关(r=0.847 9,P约0.05),见图 2。2.33 组 PBMC 中 Tim
23、-3 蛋白的表达单纯组、混合组 PBMC 中 Tim-3 相对灰度均显著高于对照组(P约0.01),且混合组高于单纯组(F=212.29,P约0.001),见图3。3讨论HSP 是一种儿童时期常见的以侵犯皮肤和血管为主的系统性血管炎性疾病,该病的临床表现主要为大小不一的紫癜,并伴有腹痛、关节痛和肾脏损害等。大量研究1-2表明,HSP 的发病机制与自身免疫密切相关。本研究结果显示,与对照组比较,HSP 患儿急性期血浆和 PBMC 中 IL-33 的表达水平明显增高(P0.01),而混合组血浆 IL-33 水平高于单纯组,说明 IL-33 可能参与 HSP 的发病,并与 HSP 临床症状的严重程度
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