血凝素诱发内质网应激反应初探_刘悦.pdf
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1、黑龙江农业科学 ():刘悦,李青超,兰英,等 血凝素诱发内质网应激反应初探 黑龙江农业科学,():血凝素诱发内质网应激反应初探刘悦,李青超,兰英,赵秀梅,刘洋,王立达,韩业辉,徐妍(黑龙江省农业科学院 齐齐哈尔分院,黑龙江 齐齐哈尔 )摘要:为促进药物结构优化和改造,利用 细胞进行转染及蛋白免疫印迹试验,研究病毒血凝素()在内质网应激反应中的作用。结果表明,不同糖基化位点蛋白差异性表达明显,蛋白可诱发内质网应激反应,且不同的蛋白样中 的表达量不同,从而引起内质网应激反应所导致的细胞凋亡也不同。关键词:流感病毒;蛋白;内质网应激反应近年来,禽流感病毒传播的趋势明显增强,使养禽业遭受巨大的经济损失
2、。为了降低流感病毒对我们的伤害,很多学者都在研究血凝素(,)的结构、功能和表达,因为禽流感病毒的毒力和抗原性与其 有着非常密切的关系。在病毒表面,属于一种主要的刺突成分,和 连接成单体,它作为一种重要的结构蛋白,可以介导禽流感病毒吸附,同时发挥致病作用(靠穿入宿主细胞的方式),同时还可以帮助宿主来抵抗禽流感,以此认为也是一种良好的保护性抗原。流感病毒的毒力会受 流 感 病 毒上 糖 基 化 位 点 的 增 减 影响。研究表明,茎部的糖基化位点一般高收稿日期:基金项目:中国科学院战略性先导科技专项()。第一作者:刘悦(),女,硕士,研究实习员,从事微生物与病毒研究。:。度保守,这些位点可能是功能
3、性 形成和保持所必需的;而头部的糖基化位点随毒株不同其结构和数量都发生变化,这可能是导致病毒多样性的重要因素之一。在病毒感染力和宿主细胞免疫反应中 连接的糖基化位点起着非常重要的作用,这一点已经被证实,尤其是蛋白酶对的裂解作用会受到裂解位点附件的糖基化位点的影响,这一现象会引起病毒毒力的变化。细胞凋亡属于是一种生理性、主动的细胞死亡。目前,细胞凋亡的通路主要有:死亡受体活化(外源性途径)、线粒体损伤途径(内源性途径)和内质网应激启动的凋亡途径。内质网应激是一种亚细胞器病理的过程,该过程会在某种条件改变下,导致细胞内质网生理功能发生一系列的紊乱现象,如蛋白质不能正确折叠。同时,可以诱发内质网应激
4、的因素还有很多,比如内质网内钙流失或钙超负荷,蛋白质糖基化形成障碍或蛋白质 ,(,):,;,(),:;期刘悦等:血凝素诱发内质网应激反应初探不能形成正常的二硫键等,这些内质网某些生理功能发生障碍的情况,内质网发生应激反应一般都会通过未折叠蛋白来进行提示。内质网应激会诱导细胞凋亡,它会通过三个主要途径来进行,其中 一 个 重 要 途 径 就 是 通 路。是 转录因子家族成员中的一分子,在内质网应激中属于特异性的转录因子。含有两个结构域,它们一个是端转录激活域,一个是 端的碱性锌指()结构域。、以及 都能诱导 的转录,其中 是 蛋白表达主要途径。在正常情况下,的分布范围并不是很广,主要集中存在于细
5、胞质中,并且含量非常低。的过量表达是促进细胞凋亡的一个重 要 因 素,在 细 胞 处 于 应 激 状 态 的 时 候,的表达量会大大增加,并且在细胞核内聚集。有几种凋亡反应蛋白,如 ,和死亡受体 等。本文是利用 细胞,做蛋白免疫印迹()实验,来研究流感病毒血凝素在内质网应激反应中的作用,以期为进一步的药物结构优化和改造提供空间。材料与仪器 细胞 细胞由黑龙江省农业科学院实验室保存。质粒 、等。试验试剂转染试剂 (公司)、胰酶(公司,美国)、细胞培养液(购自 )、(武 汉 博 士 德 生 物 有 限 公 司),兔源多克隆抗体及羊抗兔 (购自 )。缓冲液 甘氨酸电泳缓冲液:碱 、甘氨酸(电泳级,)
6、、聚丙烯酰胺(分离胶,):、()、过 硫 氨 酸 、。聚丙烯酰胺(浓缩胶 ):、()、过硫酸胺 、。缓冲液 、甲醇 、加 至总量为 。():、。:在 中 加 入 终 浓 度 为 即可。脱脂乳:奶粉 。仪器设备高速离心机(购自 公司)、细胞恒温培养箱(上海三腾仪器有限公司)、超纯水仪购自 公司、显影仪(购自上海天能公司)、摇床、湿转的转膜槽等。方法 蛋白量检测及对内质网的应激反应检测 细胞转染准备在细胞培养箱内取出生长良好的 细胞,加入 预热 的 胰酶,轻轻移动,使胰酶可以充分消化到细胞,置于 培养箱,消化 ,取出消化好的细胞,加入 预热了的但没有加血清的细胞培养液,用长管的吸液枪将细胞吹起来,
7、按 个细胞孔的密度接种到无菌孔细胞培养板,等细胞长至 时进行转染。质粒转染稀释 :取 无血清的 在 管中,再加入 。稀释质粒:取个 的 管,分别加入 无血清,再在每个管中依次加入目 的 质 粒:、,吹打混匀。在稀释好的质粒中分别加入之前稀释了的 ,混匀静置 ,取出培养箱内的 细胞,将每种质粒缓缓地分别加入到两个孔中,混匀后放回细胞培养箱中。待细胞培养后,进行换液处理,沿着孔板每个孔壁的一侧,慢慢吸走悬液,避免细胞被吹起来,然后在每个孔里加入细胞营养液,最后在每种质粒的其中一孔加入 的驱动蛋白()。提取蛋白 后,取出培养箱内的细胞,无菌下贴孔板的一侧用自动吸管将孔板中细胞悬液吸出。在室温下,每孔
8、加入 混匀,放入新的 管内,离心 ,弃上清,在每个管中加入 的细黑龙江农业科学期胞裂解液(),在漩涡振荡器上振荡,离心 ,吸上清置于 的离心管中,加入 的上样缓冲液,吹打混匀,放在水浴锅中煮沸 ,置于 冰箱里保存。凝胶的制备及电泳具体步骤和方法参考文献 。转膜(干转)取下凝胶模子,将凝胶片取出用小绿铲子将凝胶孔切掉,把切好的胶及滤纸放入 中,将 膜先在纯甲醇中浸泡,放入 中,然后按照层滤纸膜胶层滤纸装配,每一层都要用玻璃管赶走气泡,上下两层滤纸不要对齐,错开放置,以免造成电源短路,将多余的滤纸边缘剪掉,最后一次性盖好转膜仪的盖子,连上电源,调节电流 ,转膜时间为。封闭把转完的膜放在加有 脱脂乳
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