温补脾肾经验方治疗视神经脊...病作用机制的网络药理学分析_宫玉霜.pdf
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1、第 49 卷 第 2 期2023年 3 月吉林大学学报(医学版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.49 No.2Mar.2023DOI:10.13481/j.1671587X.20230201温补脾肾经验方治疗视神经脊髓炎谱系疾病作用机制的网络药理学分析宫玉霜1,付业繁2,许会静2,郭健2,相琳1,胡睿1,樊睿1,王捷3,李淼1,孙美艳2(1.吉林大学中日联谊医院神经外科,吉林 长春 130033;2.吉林医药学院检验学院实验中心,吉林 吉林 132013;3.吉林大学中日联谊医院神经内科,吉林 长春 130033)摘要 目的目的
2、:通过网络药理学分析和动物实验探讨温补脾肾经验方(TSKEP)治疗视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)的潜在作用靶点和信号通路,为治疗 NMOSD 提供理论依据。方法方法:采用中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)筛选 TSKEP 的化合物和靶点,通过 GendCard 等数据库确定 NMOSD 的相关靶点基因;构建化合物-靶点网络确定核心化合物;利用 STRING 数据库和Cytoscape 3.6.0软件中的 Network Analyzer插件获得蛋白-蛋白互作(PPI)网络的拓扑参数并识别核心靶点;利用 OmicShare 平台对核心靶点进行基因本体论(GO)功能注释分析和京都基因
3、与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析并构建靶点-通路网络,以识别关键的生物过程和信号通路;基于AutoDock软件对核心化合物和核心靶点进行分子对接。18只小鼠分为对照组、NMOSD 组和 TSKEP组,每组 6只,HE染色观察 3组小鼠大脑组织病理形态表现,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠血清中相关细胞因子水平。结果结果:动物实验,TSKEP 组小鼠神经功能缺损评分与 NMOSD 组比较明显降低(P0.01),同时 TSKEP 组小鼠 中 枢 神 经 系 统 炎 性 细 胞 浸 润 程 度 较 轻。共筛选出304 个活性化合物和 655 个药物靶点,其中与 TSKEP 治疗
4、NMOSD 相关的靶点有 43 个。槲皮素、木犀草素和豆甾醇等可能是核心化合物,白细胞介素 6(IL-6)、白细胞介素 1(IL-1)和肿瘤坏死因子 (TNF-)等可能是潜在的核心靶点。KEGG 通路富集分析及靶点-通路网络提示 TSKEP 主要通过 14 条信号通路发挥治疗 NMOSD 作用。分子对接验证结果表明核心化合物与核心靶点之间结合良好。与 NMOSD 组和对照组比较,TSKEP组小鼠血清中相关炎性细胞因子水平降低(P0.05或 P0.01)。结论结论:基于网络药理学和动物实验验证,TSKEP可通过多靶点和多条信号通路调控血清中炎性细胞因子的表达并促进神经功能的修复再生,减轻中枢神经
5、系统的炎症反应,从而发挥治疗作用。关键词 视神经脊髓炎谱系疾病;温补脾肾经验方;网络药理学;分子对接中图分类号 R744.52文献标志码 ANetwork pharmacology analysis on mechanism of Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription in treatment of neuromyelitis optica spectrum disordersGONG Yushuang1,FU Yefan2,XU Huijing2,GUO Jian2,XIANG Lin1,HU Rui1,FAN Rui1,文章编
6、号 1671587X(2023)02026111收稿日期 20220512基金项目 国家自然科学基金项目(81771304);吉林省科技厅科技发展计划项目(20200201623JC);吉林省卫健委卫生科研人才专项项目(2019SCZ037);吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20210500KJ)作者简介 宫玉霜(1995),女,山东省威海市人,在读硕士研究生,主要从事视神经脊髓炎谱系疾病的发病机制和治疗等方面的研究。通信作者 孙美艳,教授,硕士研究生导师(E-mail:);李 淼,教授,博士研究生导师(E-mail:)261第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报(医
7、学版)WANG Jie3,LI Miao1,SUN Meiyan2(1.Department of Neurosurgery,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun 130033,China;2.Experiment Center,College of Laboratory Medicine,Jilin Medical University,Jilin 132013,China;3.Department of Neurology,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Chang
8、chun 130033,China)ABSTRACT Objective:To discuss the potential targets and signaling pathways of Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription(TSKEP)in the treatment of neuromyelitis optica spectrum disorders(NMOSD)through network pharmacology analysis and animal experiment,and to provide the th
9、eoretical basis for the treatment of NMOSD.Method:Traditional Chinese Medicine System Analysis Platform(TCMSP)Database was used to screen the chemical compounds and targets of TSKEP;the related target genes in NMOSD were comfirmed through GendCard and other Databases;the core compounds were obtained
10、 by building the compound-target network;the STRING Database and the Network Analyzer plugin in Cytoscape 3.6.0 software were used to obtain the topology parameters of protein-protein interaction(PPI)network and to identify the core targets;Omicshare platform was used to perform the Geno Ontology(GO
11、)and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway enrichment analysis and the target-pathway network was conducted to identify core key biological processes and signaling pathways;the molecular docking of core compounds and core targets was performed based on AutoDock software.Eighteen mice
12、were divided into control group,NMOSD group,and TSKEP group,and there were 6 mice in each group.The morphology of brain tissue of the mice in various groups were observed by HE staining,and the levels of related cytokines in serum of the mice were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)
13、method.Results:The animal experiment results showed that compared with NMOSD group,the score of neural function defect of the mice in TSKEP group was decreased(P0.01),and the degree of inflammatory cell infiltration in central nervous system of the mice in TSKEP group was allevited.A total of 304 ac
14、tive compounds and 655 drug targets were screened,and 43 potential targets were related to the treatment of NMOSD with TSKEP.Quercetin,luteolin,and stigmasterol may be the core compounds,and interleukin-6(IL-6),interlleukin-1(IL-1),tumor necrosis factor-(TNF-)could be the poetential core targets.The
15、 KEGG pathway enrichment analysis and network analysis results showed that TSKEP may play an important role in the treatment of NMOSD through 14 signaling pathways.The molecular docking verification results showed that core compounds combined well with the core targets.Compared with NMOSD group and
16、control group,the levels of serum inflammatory cytokines of the mice in TSKEP group were decreased(P0.05 or P0.01).Conclusion:Based on the verification of network pharmacology and animal experiment,TSKEP can exert the therapeutic effect through regulating the expressions of serum inflammatory cytoki
17、nes,promoting the repairment and regeneration of nerve function,and reducing the inflammatory response of the central nervous system by multiple targets and signaling pathways.KEYWORDS Neuromyelitis optica spectrum disorders;Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription;Network pharmacology;Mol
18、ecular docking视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是一种罕见的中枢神经系统自身免疫性炎性脱髓鞘疾病,呈复发-缓解 病 程,可 导 致 失 明 及 长 节 段 脊 髓 损 伤1-2。NMOSD 好发于 32.645.7岁女性人群3,其发病机制尚未完全明确。目前主要通过糖皮质激素和血浆置换等方法缓解急性期症状,缓解期多以免疫抑制剂和单克隆抗体进行治疗,但以上治疗费用高昂且效果不佳,甚至存在严重不良反应。因此,如何为 NMOSD 患者提供安全有效的治疗方法仍是临床262宫玉霜,等.温补脾肾经验方治疗视神经脊髓
19、炎谱系疾病作用机制的网络药理学分析面临的一大难题。NMOSD 在中医学领域中属于“痿病”“暴盲”范畴4。研究5显示:NMOSD以“脾肾阳虚”“痰淤湿热”等为病机。灵枢海论 云:“髓海不足,目无所见,懈怠安卧”。中医学认为:肾藏精,为先天之本,主骨生髓,肾阳虚衰,髓海空虚,不能充髓生骨,则会腰膝酸软,肢冷麻木无力,发为痿病,髓海空虚亦不能充养睛目,目失所养而视物模糊,发为青盲病。黄帝内经灵枢本神 记载:“脾虚则四肢不用。若脾虚弱,则气血乏源,运化布散精气失司,则视物昏花、肌肉筋骨痿弱麻木无力”,因此导致视力障碍和运动障碍,治疗上则以“补脾益肾、填精补髓”为治疗要点。由吉林大学中日联谊医院中医科教
20、授亲自拟定的由 15 味中药组成的温补脾肾经验 方(Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription,TSKEP),主要被用于近 5 年来明确诊断为 NMOSD 且于门诊复诊的约 30 例患者。其中熟地黄滋阴填精益血、补益肝肾;黄连及三颗针清热燥湿、泻火解毒;黄芪可大补元气、健脾益气;茯苓及白术渗湿健脾以杜生痰之源;当归养血活血。诸药合用,可改善 NMOSD 患者临床症状,减轻神经功能缺损,降低复发频率,临床疗效显著。鉴于中药方剂多组分和多靶点的作用特点,TSKEP 治疗 NMOSD 的效果及发病机制尚未完全明确。本研究应用网络药理学及分子对
21、接的方法构建多维靶点网络,探索 TSKEP 治疗 NMOSD 的效果及其作用机制,为其临床应用提供科学依据。1 材料与方法 1.1实验动物实验动物、药物药物、主要试剂和仪器主要试剂和仪器SPF 级C57BL/6 雌性小鼠,体质量(255)g,购自吉林大学实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(吉)2021-0001。实验由吉林大学中日联谊医院伦理委员会审查批准,编号:2017-104。小鼠分为对照组、NMOSD组和TSKEP组,每组6只。2019 年10月2021年 10月收集 10例 NMOSD 患者和 10名健康志愿者的血清标本,10 例患者均在吉林大学中日联谊医院就诊并参照 2015
22、年 NMOSD 的诊断标 准 明 确 诊 断 为 抗 水 通 道 蛋 白 4 抗 体(anti-aquaporin 4-immunoglobulin,AQP4-IgG)阳 性 的NMOSD。本研究使用的人血清标本获得吉林大学中 日 联 谊 医 院 伦 理 委 员 会 批 准,编 号:2017022238。TSKEP 由吉林医药学院药学系制备,中药复方由 15味中药组成:熟地 15 g,千金藤 30 g,山栀10 g,枸杞 15 g,牡丹皮10 g,当归15 g,黄连10 g,十大功劳叶 30 g,三 颗 针 30 g,黄 芪 30 g,党 参30 g,生地15 g,茯苓10 g,白术 15 g
23、,黄柏 10 g。所有中药药材均购自北京同仁堂股份有限公司并经吉林大学中日联谊医院中医科主任医师、副教授冯桂梅鉴定,均符合 中国药典 要求。中药原材料混合,加洁净的冷水浸泡 3060 min 后,每剂药煎23次,首次煎煮加水至超过药物表面35 cm;第2 和 3 次煎煮加水 至 超 过 药 物 表 面 12 cm,煎煮时沸前用强火,沸后用文火。每次煎煮滤出药汁150200 mL,煎后将 3 次药汁混合。采用旋转蒸发仪将提取液进行浓缩并在烘箱中 60 烘干至粉末状,置于 4 冰箱中备用。每 1 g 干提取物含有3.56 g生药材,临用前用水配置成相应浓度药液。Melon Gel IgG 纯化试剂
24、盒(赛默飞世尔科技公司,商品号 45206),增强型 BCA 蛋白检测试剂盒(碧云天科技公司,商品号 P0010),髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 MOG35-55(由上海顶肽生物技术公 司 合 成),酶 联 免 疫 吸 附 试 验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(上海酶联生物技术有限公司),苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,商品号 C0105S)。Amicon Ultra 离心过滤器(美国密理博科技公司,商品号 ES-A01-4243),SpectraMax M5/M5e 多 功
25、能 酶 标 仪(美 国Molecular Devices 公司),伯乐 Mini-PROTEAN Tetra小型垂直电泳套装(美国伯乐公司),5418R型Eppendorf 高速冷冻离心机(德国艾本德公司),ChemiDocTM MP 型 全 能 成 像 系 统(美 国 伯 乐 公司),爱华 QPJ-1C石蜡切片机(天津爱华医疗器械有限公司),HH-MMB-2型移动式微屏障鼠笼(苏州猴皇动物实验设备科技有限公司)。1.2NMOSD 动物模型制备及给药方式动物模型制备及给药方式用 PBS缓冲液稀释 MOG35-55至终浓度为 0.5 g L1,并与含有 12.5 g L1 热灭活结核分枝杆菌的完
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