降钙素原通过影响磷酸化蛋白激酶Cα、闭合蛋白表达损害脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能.pdf
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1、1创伤与急诊电子杂志 2023年3月 第11卷 第1期 J TRAUMA EMERG,Mar.2023,Vol.11,No.1降钙素原通过影响磷酸化蛋白激酶C、闭合蛋白表达损害脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能刘慧恒,王隽笙,林锦洲,郭梦雨,胡婷(厦门大学附属中山医院急诊部,福建厦门 361001)摘要 目的 研究降钙素原(procalcitonin,PCT)是否通过增加肠黏膜磷酸化蛋白激酶 C(p-protein kinase C,p-PKC)表达,减少闭合蛋白表达,从而损害脓毒症大鼠肠黏膜屏障。方法 120150g SPF级SD雄性大鼠20只,使用随机数表法随机分5组(每组4只)。正常组:不做任何处
2、理;脓毒症组:盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)造模;脓毒症+PCT 组:大鼠 CLP 造模后,尾静脉注射 PCT;脓毒症+PCT+Go6983组:大鼠 CLP 造模后,先后经尾静脉注射 PCT 及 Go6983(PKC 磷酸化抑制剂);脓毒症+Go6983 组:大鼠 CLP 造模后,尾静脉注射 Go6983。术后 24h 于眼静脉取血 1ml行血清 D-乳酸(D-lactic acid,D-lac)、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)浓度测定,取血后处死大鼠,留取回肠末端肠道组织行组织学、免疫组化、免疫荧光、原位末端标记法(Td
3、T-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检查。结果 与正常组比较,脓毒症组大鼠血清 D-lac、DAO 水平水平明显升高(0.390.14)mmol/L 比(5.150.66)mmol/L,(12.173.34)U/L 比(31.433.94)U/L,P 均 0.001;肠 道 组 织 中 肠 黏 膜 细 胞p-PKC 表 达 增 加(58.8511.43)103IOD 比(111.2514.96)103IOD,闭 合 蛋 白表 达 量 减 少(317.4123.46)103IOD 比(192.9815.97)103IOD,肠 黏 膜 细 胞凋 亡 增
4、加(15.930.87)103IOD 比(20.531.87)103IOD,P 均 0.001,肠 道组织病理损伤加重。与脓毒症组比较,脓毒症+PCT 组大鼠血清 D-lac、DAO 水平升高(5.150.66)mmol/L 比(7.550.76)mmol/L,(31.433.94)U/L 比(58.717.54)U/L,P 均 0.001,肠道组织中肠黏膜细胞 p-PKC 表达增加(111.2514.96)103IOD比(220.5124.04)103IOD,闭 合 蛋 白 表 达 量 减 少(192.9815.97)103IOD比(91.289.7)103IOD,肠 黏 膜 细 胞 凋 亡
5、 增 加(20.531.87)103IOD 比(28.051.48)103IOD,P 均 0.001,肠道组织病理损伤加重。与脓毒症+PCT 组相比,脓毒症+PCT+Go 6983 组大鼠血清 D-lac、DAO 水平升高程度减少(7.550.76)mmol/L比(5.550.73)mmol/L,(58.717.54)U/L 比(42.682.78)U/L,P 均 0.001,肠道组织中肠黏膜细胞 p-PKC 表达减少(220.5124.04)103IOD 比(157.1312.79)103IOD,P=0.002,闭合蛋白表达量增多(91.289.7)103IOD 比(131.2311.58)
6、103IOD,P 0.001,肠黏膜细胞凋亡减少(28.051.48)103IOD 比(22.660.72)103IOD,P 0.001,肠道组织病理损伤减轻。与脓毒症+PCT+Go 6983 组相比,脓毒症+Go 6983 组大鼠血清 D-lac、DAO 水平下降(5.550.73)mmol/L 比(2.820.49)mmol/L,(42.682.78)U/L 比(23.283.86)U/L,P 0.001,肠 道 组 织 中 肠 黏 膜 细 胞 p-PKC表 达 减 少(157.1312.79)103IOD 比(81.8411.53)103IOD,闭 合 蛋 白 表 达 量脓毒症基金项目:
7、福建省卫生健康科技计划项目厦门市医疗卫生科技计划项目(3502Z20194019)通信作者:王隽笙,Email:2创伤与急诊电子杂志 2023年3月 第11卷 第1期 J TRAUMA EMERG,Mar.2023,Vol.11,No.1增 加(131.2311.58)103IOD 比(260.3711.44)103IOD,肠 黏 膜 细 胞 凋 亡 减少(22.660.72)103IOD 比(19.141.05)103IOD,P 均 0.001,肠道组织病理损伤减轻。结论 PCT 使脓毒症大鼠肠黏膜细胞 p-PKC 表达增加,闭合蛋白表达减少,加重脓毒症大鼠肠屏障功能损害。关键词 降钙素原;
8、脓毒症;肠道屏障功能;磷酸化蛋白激酶 C;闭合蛋白DOI:10.16746/ki.11-9332/r.2023.01.001Procalcitonin impairs intestinal mucosal barrier by decreasing occludin expression via activation of p-PKC in septic ratsLiu Huiheng,Wang Junsheng,Lin Jinzhou,Guo Mengyu,Hu Ting(Department of Emergency,Zhongshan Hospital,Xiamen University
9、,Xiamen 361001,Fujian,China)Abstract Objective To investigate whether procalcitonin(PCT)damages the intestinal mucosal barrier in sepsis rats by increasing the expression of intestinal protein kinase C(p-PKC)and reducing the expression of occludin.Method Twenty male SD rats with SPF grade(120g150g)w
10、ere divided into five groups with random number table method:including normal group:no treatment;sepsis group:cecal ligation(CLP)model;sepsis+PCT group:PCT was injected into the caudal vein after CLP modeling;sepsis+PCT+Go 6983 group:PCT and Go 6983(p-PKC inhibitor)were injected into the tail vein a
11、fter CLP modeling;and sepsis+Go 6983:Go 6983 was injected into the caudal vein after CLP modeling.Serum D-lactic acid(D-lac)and diamine oxidase(DAO)concentrations were measured at 1 ml of ophthalmic vein blood after 24 hours.The rats were killed after blood collection,and the distal ileum intestinal
12、 tissues were retained for histological,immunohistochemical,immunofluorescence and TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)examinations.Result Compared to the normal group,the sepsis group showed a significant increase in serum D-lac level(0.390.14)mmol/L vs(5.150.66)mmol/L,P0.001,serum DAO level(
13、12.173.34)U/L vs(31.433.94)U/L,P0.001 and the expression of p-PKC(58.8511.43)103 vs(111.2514.96)103,IOD,P0.001,and a decrease in the expression of occludin(317.4123.46)103 vs(192.9815.97)103,IOD,P0.001.Intestinal mucosal cell apoptosis also increased(15.930.87)103 vs(20.531.87)103,IOD,P0.001,along w
14、ith an increase in intestinal tissue pathological injury.Compared to the sepsis group,the sepsis+PCT group showed a significant increase in serum D-lac level(0.390.14)mmol/L vs(5.150.66)mmol/L,P0.001,serum DAO level(12.173.34)U/L vs(31.433.94)U/L,P0.001 and the expression of p-PKC(58.8511.43)103 vs(
15、111.2514.96)103,IOD,P0.001,and a decrease in the expression of occludin(317.4123.46)103 vs(192.9815.97)103,IOD,P0.001.Intestinal mucosal cell apoptosis also increased(15.930.87)103 vs(20.531.87)103,IOD,P0.001,along with an increase in intestinal tissue pathological injury.Compared to the sepsis+PCT
16、group,the sepsis+PCT+Go 6983 group showed a decrease in the increase level of serum D-lac(7.550.76)mmol/L vs(5.550.73)mmol/L,P0.001,serum DAO level(58.717.54)U/L vs(42.682.78)U/L,P 0.001,and the expression of p-PKC(220.5124.04)103 vs(157.1312.79)103,IOD,P=0.002,and an increase in occludin expression
17、(91.289.7)103 vs(131.2311.58)103,IOD,P0.001,a decrease in intestinal mucosal cell apoptosis(28.051.48)103 vs(22.660.72)103,IOD,P0.001,and alleviated pathological damage of intestinal tissue.Compared to the sepsis+PCT+Go 6983 group,the sepsis+Go 6983 group showed a decrease in serum D-lac level(5.550
18、.73)mmol/L vs(2.820.49)mmol/L,P 0.001,serum DAO level(42.682.78)U/L vs(23.283.86)U/L,P0.001,and the expression of p-PKC(157.1312.79)103 vs(81.8411.53)103,3创伤与急诊电子杂志 2023年3月 第11卷 第1期 J TRAUMA EMERG,Mar.2023,Vol.11,No.1IOD,P0.001,along with an increase in the expression of occludin(131.2311.58)103 vs(
19、260.3711.44)103,IOD,P0.001,a decrease in intestinal mucosal cell apoptosis(22.660.72)103 vs(19.141.05)103,IOD,P 0.001,and alleviated pathological damage of intestinal tissue.Conclusion PCT was found to increase the expression of p-PKC while decreasing the expression of occludin in intestinal mucosal
20、 cells,which is associated with the exacerbation of intestinal barrier function injury in septic rats.Key words Procalcitonin;Sepsis;Intestinal barrier function;p-protein kinase C;Occludin降钙素原(Procalcitonin,PCT)作为临床广泛使用的炎症标志物,在脓毒症尤其是在泌尿系统、胆道系统、腹腔感染时明显升高1-3。既往的研究表明,相比于革兰氏阳性菌感染,在革兰氏阴性菌感染时PCT的升高更明显,革兰氏
21、阴性菌可通过LPS-TLR4-NFB通路激活PCT的合成4。有研究表明,PCT有直接的细胞毒性可诱导细胞凋亡5-7。在脓毒症中往往伴随肠黏膜屏障受损8,使肠菌位移,引起内毒素血症,这在一定程度上,可形成正反馈循环,使PCT在短时间内急剧升高,从而导致机体持续损害。紧密连接(tight junction,TJ)在肠黏膜屏障中起到重要作用,闭合蛋白是TJ的重要成分9-10,多种细胞外分子可通过调控蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的磷酸化而影响闭合蛋白的表达11-12,PCT的升高常常伴随肠黏膜屏障损害,脓毒症时炎症介质和内毒素相关的PCT升高可能诱导肠黏膜细胞凋亡增加和肠上皮
22、TJ损害。因此,PCT可能成为脓毒症干预的新靶点。PCT的病理学作用尚未被完全阐明,本文通过建立脓毒症大鼠模型,研究PCT是否通过影响磷酸化的PKC(p-PKC)、闭合蛋白表达损害脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能。1 材料与方法1.1 实验动物及分组 成年雄性清洁级SD大鼠(体重120150g)20只,所有实验大鼠均购自上海市斯莱克实验动物公司,饲养于厦门大学实验动物中心,实验动物生产许可证:SCXK(沪)2017-0005。温度控制在25,光暗周期为12h,大鼠可自由获取食物和水。实验过程均严格遵守动物福利与伦理准则和指南的相关规定。以随机数表对每只大鼠行随机编号,以其号数除以5的余数作为分组依据,
23、余数0编为正常组,余数1编为脓毒症组,依次类推。20只大鼠,随机分为5组,每组4只。正常组:不做任何处理;脓毒症组:盲肠结扎穿孔法13-15(cecal ligation and puncture,CLP)造模;脓毒症+PCT组:大鼠行CLP术,术后通过尾静脉注射PCT(30mg/kg)16;脓毒症+PCT+Go 6983组:大鼠行CLP术,术后经尾静脉注射PCT(30mg/kg)及Go 6983PKC磷酸化抑制剂,10mmol/(Lkg)17;脓毒症+Go 6983组:大鼠行CLP术,术后经尾静脉注射Go 698310mmol/(Lkg)。本实验通过大鼠的行为、毛色、生化指标及各脏器功能评估
24、造模是否成功,脓毒症造模一致性评价等具体见本课题组先前发表的论著4。1.2 主要仪器和试剂 PCT购自中国近岸蛋白公司(Catalog No.CF96);Go 6983,购自美国Med Chem Express(Catalog HY-13689);一抗闭合蛋白购自美国Affnity公司(Catalog DF7504);一抗p-PKC购自美国Affnity公司(Catalog AF8396);荧光二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)Fluor488-conjugated)购自美国Affnity公司(Catalog No.S0018);Tunel试剂盒购自大连美伦生物有限公司。免
25、疫组化相关试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司;D-乳酸(D-Lactic acid,D-lac)试剂盒、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,荧光显微镜AxioVertA1荧光显微镜购自德国ZEISS公司。1.3 标本收集 各组大鼠经处理后24h眼静脉取血1ml,3000转/min 3min分离出血清,80冻存,用于血清D-lac、DAO检测,而后过量麻醉法处死大鼠,留取回肠末端肠道组织置入4%甲醛固定。按病理学常规梯度脱水、透明、包埋制作蜡块。行组织学、免疫组化、原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labe
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