麻叶荨麻安全性评估及对脂多糖诱导雏鸡肠道炎性变化的保护作用.pdf
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1、动物营养学报,():麻叶荨麻安全性评估及对脂多糖诱导雏鸡肠道炎性变化的保护作用康 威 王德升 陈泓松 蔡晓旭 尹晓宇 刘乌云 杨景峰 董 武(内蒙古民族大学动物科技学院,内蒙古自治区毒物监控及毒理学重点实验室,通辽;蒙古国国立生命科学大学,动物科学与生物技术学院,乌兰巴托)摘 要:本试验旨在评估麻叶荨麻的安全性并研究其对脂多糖()诱导雏鸡肠道炎症的影响。试验选用受精后 的正常 系斑马鱼胚胎,对照组加入 的 二甲基亚砜(),试验组分别加入 浓度为、和 的麻叶荨麻乙醇提取液,并于受精后 加入 的 处理液用于炎症诱导,直到受精后 。然后,选择体重()接近的 日龄浦东鸡 只,随机分为 组,分别是对照组
2、、组、麻叶荨麻组、麻叶荨麻组、麻叶荨麻 组和 麻叶荨麻 组,每组 个重复,每个重复 只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂在基础饲粮中分别添加 和 麻叶荨麻粉的饲粮。试验期 。试验第 天,给麻叶荨麻 组试验鸡灌服 浓度为 的,持续 。结果表明:)受精后 ,与对照组相比,麻叶荨麻乙醇提取液在浓度为 及以下时对斑马鱼胚胎存活率、孵化率和畸形率均无显著影响()。与对照组相比,组斑马鱼幼鱼白细胞介素()和肿瘤坏死因子()相对表达量显著提高();与 组相比,麻叶荨麻 组斑马鱼幼鱼白细胞介素()和 相对表达量显著降低()。)与对照组相比,组雏鸡十二指肠绒毛高度和绒毛高度 隐窝深度值显著降低(),十二指肠杯状
3、细胞数量显著减少(),十二指肠 和 相对表达量显著提高();与 组相比,麻叶荨麻 组和 麻叶荨麻 组十二指肠绒毛高度和绒毛高度 隐窝深度值显著提高(),十二指肠杯状细胞数量有增加趋势(),十二指肠 和 相对表达量显著降低(),且与对照组相比均无显著差异()。综上所述,麻叶荨麻对 诱导的斑马鱼和雏鸡肠道发育障碍和炎症有显著的抑制作用,能够提高机体免疫力,但饲粮中的添加比例应控制在 或者 以下。关键词:麻叶荨麻;斑马鱼;浦东鸡;脂多糖;炎症;安全性评估中图分类号:文献标识码:文章编号:()收稿日期:基金项目:内蒙古自然科学基金();内蒙古科技创新引导资助项目();内蒙古民族大学研究生科研创新资助项
4、目();学科交叉创新团队建设项目(董武 年度);科研创新平台能力建设支持计划(薛江东 年度);内蒙古民族大学科研业务费(,)作者简介:康 威(),男,甘肃白银人,硕士研究生,研究方向为畜牧学。:通信作者:董 武,教授,硕士生导师,:近年来,国家和内蒙古自治区政府对内蒙古畜牧业经济发展提供了有力支持,但草原天然牧草资源开发不足,尤其是非常规天然牧草没有得到充分高效利用,加上有些天然牧草生物属性特殊,如麻叶荨麻()茎叶上有刺导致家畜不能直接采食,尖头叶藜鲜草适口性动 物 营 养 学 报 卷差等问题使其未能充分利用和开发,这使得有关荨麻的安全性及可用性都有待深入研究。麻叶荨麻属于荨麻科(),是一种
5、年或多年生草本植物,在北半球大部分地域均有分布,在我国主要生长于北方地区,如新疆、内蒙古、辽宁、河北以及青海等地。麻叶荨麻具有抗寒、抗旱和耐瘠薄等优良特性。荨麻全株营养期的粗蛋白质含量高达,粗灰分含量高达,并且荨麻中 的蛋白质为可消化蛋白质。麻叶荨麻在生长发育前期非必需氨基酸积累较快,后期必需氨基酸积累加快,氨基酸总量维持在。此外,荨麻成熟期粗脂肪含量高达,高于同期苜蓿中的含量。麻叶荨麻丰富的营养价值及潜在的饲用价值,近年来得到了人们的广泛关注。刘乌云等研究发现,麻叶荨麻干草与尖头叶藜干草以 或 混合后替代粗饲料的全混合日粮()可以提高蒙古公牛的养分表观消化率和生长性能,促进其骨骼和肌肉的生长
6、发育,使用荨麻能够提高羊、鸡、鹌鹑及兔子的生产性能也有类似的报道。荨麻除了用于饲料添加,也被用于药物开发。荨麻含有多种具有生物活性的化合物,如组胺、血清素等酚类化合物和黄酮类化合物,年荨麻被我国卫生部药品标准 年版(藏药)第 册收录其中,全草或根入药用于抗炎。研究发现,不同剂量麻叶荨麻浸膏具有良好的抗炎镇痛作用,效果与阿司匹林相近。有关麻叶荨麻提取物的安全性检测不详,麻叶荨麻的抗炎和提高免疫力机制还有待进一步研究。斑马鱼()是一种经济、敏感性强及容易操作的实验动物模型,胚胎发育期更适合药物的安全评估。因此,本研究旨在采用斑马鱼模型评估麻叶荨麻的安全性,同时使用雏鸡作为研究对象,探索麻叶荨麻用作
7、饲料添加剂对脂多糖()诱导的雏鸡十二指肠炎性变化的保护作用,为后续麻叶荨麻在家畜饲料中的应用提供支撑。材料与方法 试验材料 麻叶荨麻叶片乙醇提取液的制备:采集 新鲜麻叶荨麻叶片(采自内蒙古锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗),清洗表面泥土后将叶片浸泡在 无水乙醇中 ,将所得产物用细纱网过滤,之后放置在密闭通风橱内风干 ,随后加入 二甲基亚砜()溶解平皿中所留物质,配制成不同浓度的溶液,并分装于 下保存。系斑马鱼胚胎由内蒙古民族大学内蒙古自治区毒物监控及毒理学重点实验室提供,饲养于斑马鱼养殖系统中(北京某公司);浦东鸡(九斤黄)购买于上海某家禽养殖基地。试验设计 选取受精后 的正常 系斑马鱼胚胎,根据试验要
8、求,随机分为 组,每组 个重复,每个重复 枚。受试胚胎采用斑马鱼培养液林格氏液()液,其中 、水洗 遍后转移至无菌 孔板中,加入 液,随后对照组加入 的 ;试验组分别加入 浓度为、和 的麻叶荨 麻 乙 醇 提 取 液,并 于 受 精 后 加 入 的 处理液用于炎症诱导。受试胚胎放置在恒温保温箱(,美国)中,每间隔 在体式显微镜(,德国)下观察,在进行形态学检测时,记录各组存活率、孵化率、畸形率以及形态学变化等数据,直到受精后 。实施组织切片时,用 多聚甲醛()固定后备用。进行 检测时,在受精后 时收集斑马鱼幼鱼,使用 试剂(,美国)提取 备用。挑选个体之间体重()接近的 日龄浦东鸡 只,随机分
9、为 组,分别是对照组、组、麻叶荨麻组、麻叶荨麻组、麻叶荨麻 组和 麻叶荨麻 组,每组 个重复,每个重复 只鸡。对照组饲喂商品化基础饲粮,产品标准编号为 ;试验组饲喂在基础饲粮中分别添加 和 麻叶荨麻粉的饲粮。试验期 。试验第 天:给麻叶荨麻 组试验鸡灌服 浓度为 的,持续 ,试验第 天:称重解剖。在试验第 天时,进行组织学及免疫组化检查时,收集雏鸡十二指肠固定在 中备用。进行 检测时,收集雏鸡十二指肠,清洗后使用 试剂提取 备用。饲养管理 正常 系斑马鱼养殖在斑马鱼养殖系统中,光照黑暗时间为 ,水温保持在(期康 威等:麻叶荨麻安全性评估及对脂多糖诱导雏鸡肠道炎性变化的保护作用),每天:和:均饲
10、喂颗粒料和丰年虫,:进行公母鱼合缸,黑色幕布遮盖,次日:开始掀开幕布并收集胚胎。雏鸡饲喂采用网上平养模式,试验期间肉鸡自由采食,充足饮水,养殖环境均保持一致。每天观察雏鸡精神状态,采食情况,并称量体重。检测指标及方法 存活率、孵化率和畸形率存活率胚胎总存活数 胚胎总数;孵化率胚胎总孵化数 胚胎总数;畸形率胚胎总畸形数 胚胎总数。斑马鱼切片及肠道杯状细胞数量 在受精后 时收集斑马鱼幼鱼,采集肠道并实施包埋和组织切片,然后进行苏木精伊红()染色并使用 软件对相同肠道内杯状细胞数量进行统计。雏鸡体重 在饲养试验进行到第 天时每天:给各组雏鸡称重,连续 ,监测服用 后雏鸡体重的变化。雏鸡十二指肠的收集
11、及 染色 在饲养试验第 天,将所有雏鸡处死,解剖取出 十二指肠,装入含有 溶液的离心管中,过夜。然后用 酒精脱水 ,共 次,之后进行系列梯度酒精(、和 的 酒 精)脱 水 和 石 蜡 包 埋。接 着 制 作 的切片并进行 染色,染色时先用二甲苯和脱蜡各 ,然后经过梯度酒精水合浸染 苏木精、盐酸酒精、氨水和 伊红染液,之后再次脱水透明,最后晾干后封片镜检,记录肠道绒毛高度、绒毛宽度、绒毛面积和隐窝深度,并计算绒毛高度 隐窝深度值。雏鸡十二指肠糖原染色 饲养试验第 天时收集雏鸡十二指肠肠管,用 固定过夜,经过脱水包埋后制成蜡块用于切片;将切片放入 染色液,置于室温阴暗处浸染 ,之后使用自来水冲洗
12、;再将切片置于苏木素染色液中浸染 ,酸性分化液 ;自来水冲洗后再用梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固后镜检观察。记录肠道杯状细胞数量。总 提取、生成和实时荧光定量 收集受精后 时的斑马鱼幼鱼或者饲养试验第 天时的雏鸡十二指肠,采用 试剂盒提取总,并进行 纯度检测(纯度要求 和 超 过 )。并 使 用 (,美国)进行反转录,获取 模板。使 用 进 行 检测,基因引物序列见表,反应溶液总容量为 ,分别以 和 肌动蛋白()作为内参基因,并使用 方法计算目的基因 相对表达量。数据统计分析 本试验数据均采用 及 软件进行单因素和双因素方差分析,并采用 氏法进行多重比较,结果数据用“平均值标准差()”
13、表示,表示差异显著。表 引物序列 动物基因引物序列 ()引物序号 产物长度 斑马鱼肿瘤坏死因子:白细胞介素:白细胞介素:动 物 营 养 学 报 卷续表 动物基因引物序列 ()引物序号 产物长度 浦东鸡白细胞介素:白细胞介素:肿瘤坏死因子:肌动蛋白:结果与分析 麻叶荨麻对斑马鱼胚胎存活率和孵化率的影响 由表 可知,在受精后 时,对照组和、和 麻叶荨麻组斑马鱼胚胎存活率分别为、和;与 对 照 组 相 比,和 麻叶荨麻组胚胎存活率显著降低()。由表 可知,在受精后 时,对照组和麻叶荨麻组斑马鱼胚胎孵化率均达到。此外,本试验通过急性毒性试验估算出麻叶荨麻的半致死浓度()为 。麻叶荨麻对斑马鱼胚胎发育的
14、影响 由表 可知,麻叶荨麻乙醇提取液浓度在 以下时,对斑马鱼胚胎畸形率无显著影响();在受精后 时,麻叶荨麻组斑马鱼胚胎畸形率显著提高();在受精后 和 时,和 麻叶荨麻组斑马鱼胚胎畸形率显著提高()。图 展示了斑马鱼鱼鳔面积、鱼尾弯曲比例和心囊面积。在受精后 时,斑马鱼胚胎出现畸形,主要表现为鳔的膨胀不足;在受精后 时,除了鳔的膨胀不足和尾部弯曲外,麻叶荨麻组还出现心囊浮肿。由表 可知,与对照组相比,和 麻叶荨麻组鱼尾弯曲比例显著升高(),鱼 鳔 面 积 显 著 减 小();麻叶荨麻组心囊水肿面积显著增大()。麻叶荨麻对 诱导斑马鱼肠道发育的影响 由表 和图 可知,各组间斑马鱼肠道杯状细胞数
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