基于Cu,Fe-N-C氧化...建邻苯二甲酸酯荧光检测探针_李宏.pdf
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1、306 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测基于Cu,Fe-N-C氧化酶活性构建邻苯二甲酸酯荧光检测探针李 宏1,2,史 巧1,陈骏飞1,王馨蕊1,汤回花1,李秋兰2,杨德志2,杨亚玲2,*(1.云南省农业科学院农产品加工研究所,云南 昆明 650221;2.昆明理工大学生命科学与技术学院,云南 昆明 650500)摘 要:基于邻苯二甲酸酯(phthalic acid ester,PAEs)对双金属原子Cu,Fe-N-C纳米酶模拟氧化酶活性的调节,建立简单、灵敏测定发酵食品中PAEs的荧光探针方法。PAEs吸附于Cu,Fe-N-C表面后,会加速Cu,Fe-N-C催化氧化底物邻
2、苯二胺,使生成的2,3-二氨基吩嗪产物荧光强度增加,PAEs在1.2550 g/L范围内呈良好的线性关系。将该研究方法用于PAEs含量的测定,其检出限可达到0.76 g/L,实际样品的加标回收率在88.0%104.6%范围内,满足GB 5009.2712016中的检测要求。该方法具有简便、稳定、快速等特点,其检出限也低于国家规定的食品中PAEs含量的限值。关键词:邻苯二甲酸酯;纳米酶;氧化酶活性;荧光探针A Fluorescent Probe Based on Cu,Fe-N-C Nanozyme with Oxidase-like Activity for Detection of Phth
3、alate EstersLI Hong1,2,SHI Qiao1,CHEN Junfei1,WANG Xinrui1,TANG Huihua1,LI Qiulan2,YANG Dezhi2,YANG Yaling2,*(1.Institute of Agro-products Processing,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650221,China;2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Technology,Kunming 650500,
4、China)Abstract:A simple and sensitive fluorescent probe for the determination of phalic acid ester(PAEs)in fermented foods was developed based on the fact that the oxidase-like activity of Cu,Fe-N-C nanozyme can be regulated by PAEs.After PAEs were adsorbed on the surface of Cu,Fe-N-C,the catalytic
5、oxidation of the substrate o-phenylenediamine(OPD)was accelerated,thus increasing the fluorescence intensity of the generated 2,3-diaminophenazine(DAP).The calibration curve for PAEs showed a good linear relationship in the concentration range of 1.2550 g/L.The detection limit of the proposed method
6、 was 0.76 g/L.The recoveries of spiked samples ranged from 88.0%to 104.6%,which meet the detection requirements of the national standard GB 5009.271-2016.This method is simple,stable and rapid,and its detection limit is lower than the national limit for PAEs content in foods.Keywords:phthalic acid e
7、sters;nanozyme;oxidase-like activity;fluorescent probeDOI:10.7506/spkx1002-6630-20211213-143中图分类号:TS255.7 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)04-0306-07引文格式:李宏,史巧,陈骏飞,等.基于Cu,Fe-N-C氧化酶活性构建邻苯二甲酸酯荧光检测探针J.食品科学,2023,44(4):306-312.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211213-143.http:/ LI Hong,SHI Qiao,CHEN Junfei,et al.A
8、fluorescent probe based on Cu,Fe-N-C nanozyme with oxidase-like activity for detection of phthalate estersJ.Food Science,2023,44(4):306-312.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211213-143.http:/收稿日期:2021-12-13基金项目:云南省重大科技专项(202002AE320006)第一作者简介:李宏(1974)(ORCID:0000-0002-0877
9、-8867),男,研究员,硕士,研究方向为农产品加工。E-mail:*通信作者简介:杨亚玲(1964)(ORCID:0000-0003-0115-7563),女,教授,博士,研究方向为分析化学。E-mail:邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是一个化合物系列,主要用于生产柔性聚氯乙烯或乙烯基产品,是最常用的塑化剂之一。PAEs与塑料主体以分子间相互作用力的形式结合,较易转移到各种环境中,对空安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.04 307气、土壤、水源甚至食品造成污染1-3。PAEs是一种环境激素类物质,可在生物体内富集而产生毒性作用,引起肝脏、免
10、疫、生殖内分泌和胚胎发育毒性等,严重威胁人们的身体健康4-6。我国在2016年发布了关于PAEs的食品国家标准,对食品中PAEs含量限制范围作出明确规定7-8。目前,PAEs检测主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱-质谱联用技术、近红外光谱分析技术、荧光光谱法以及实时荧光定量聚合酶链式反应技术等9-15。荧光光谱法具有检测便捷、灵敏度高、重现性好、强选择性等优势16,但由于PAEs分子本身不能发出荧光17-18,各种PAEs的荧光检测主要集中在对PAEs进行衍生,通过间接荧光 法检测PAEs19-20。自2007年我国科学家阎锡蕴发现四氧化三铁磁性纳米颗粒本身
11、具有类过氧化物酶的催化活性以来21,纳米酶的研究得到快速发展,由于其稳定性高、易于生产及成本低,可作为天然酶的替代品等优势,成为研究 热点22-23。其中单原子纳米酶由于与天然金属酶的M-Nx位点相似,表现出优异的催化活性及选择性,受到广泛关注24,在单原子纳米酶中引入第2个过渡金属原子,可以改善酶活性,提高对底催化的选择性25-27。本研究利用热解法合成了铜、铁双原子纳米酶(Cu,Fe-N-C),基于PAEs调节Cu,Fe-N-C氧化物模拟酶活性,建立荧光检测新方法。如图1所示,Cu,Fe-N-C能催化邻苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)生成黄色荧光产物2,3-二氨基吩嗪
12、(2,3-diaminophenazine,DAP)。而PAEs的加入会增强催化体系的荧光强度,由此建立痕量PAEs的荧光探针检测方法。邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(dioctyl phthalate,DOP)、邻苯二甲酸二壬酯(dinonyl phthalate,DINP)5 种PAEs类物质有此现象,该方法检测这5 种PAEs的总量。OPDOPD:DAP:PAEs:NH2NH2OOORORNH2NNNH2DAP
13、PAEsCu,Fe-N-C图 1 PAEs检测示意图Fig.1 Schematic diagram of PAE detection1 材料与方法1.1 材料与试剂酱腌菜样品,购自云南昆明市呈贡区超市。DMP、DEP、DBP、DOP、DINP、(分析纯,纯度99%)中国医药集团上海化学试剂公司;氯化铜(CuCl2)、氯化铁(FeCl3)、中-四(4-羧基苯基)卟吩、甲醇、3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)、OPD、2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline
14、-6-sulfonic acid),ABTS)上海阿拉丁生化科技股份有限公司。1.2 仪器与设备GS800A分子荧光光谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司;UV-2600紫外-可见分光光度计 岛津(上海)实验器材有限公司;Tecnai G2 TF30场发射透射电子显微镜 荷兰FEI公司;X射线衍射仪、TENsoR27型傅里叶红外光谱分析仪 德国Bruker公司;XW-800快速混匀器 上海汗诺仪器有限公司;HC-3018R型高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;高温管式炉 上海贝克有限公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;pHS-3B精密酸度计 赛多利斯(上海)贸易有限公司;78
15、-1型磁力加热搅拌器 上海南汇电讯器材厂;AB204-S电子分析 天平 梅特勒-托利多科技(中国)有限公司。1.3 方法1.3.1 Cu,Fe-N-C材料的制备参照Lin Zhen28和Huang Xuemin29等的研究进行改进。对配体分子的筛选,材料制备方法如下:10 mL甲醇中含有2.636 g CuCl2作为溶液A,20 mL甲醇中含有5 g中-四(4-羧基苯基)卟吩和2.376 g FeCl3(按Cu、Fe物质的量比1 1计算得到)作为溶液B,将A和B两种溶液均匀混合并80 烘箱干燥老化2 h。得到的墨绿色干燥粉末称取5 g于石英舟中,管式炉750 在N2保护下煅烧2 h得到黑色粉末
16、。粉末于硫酸溶液(H2SO4 H2O=1 9,V/V)中12 h浸泡后用水反复冲洗。干燥后,后续用实验用水配制成质量浓度为0.5 mg/mL的悬浮液使用。1.3.2 PAEs的检测以DMP为PAEs的模式物,在EP管中依次加入100 L Cu,Fe-N-C和50 L 100 mmol/L OPD,一定质量浓度的DMP标准溶液,2 mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液,充分混匀,室温孵育10 min后,于8 000 r/min离心3 min,取上层清液在421 nm激发波长下,564 nm发射波长处测定荧光强度。设定I=II0,I表示加入DMP后溶液的荧光强度;I0表示未加入DMP作空白时溶液的荧光
17、强度。308 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测1.3.3 Cu,Fe-N-C材料酶活性的测定采用TMB及ABTS显色反应测定Cu,Fe-N-C纳米酶的活性。首先,将100 L Cu,Fe-N-C、100 mmol/L的TMB及ABTS各50 L,加入到2 mL pH 4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液,充分混匀,室温孵育10 min后,于8 000 r/min离心3 min,取上层清液用紫外-可见分光光度计在652 nm及415 nm波长处测定吸光度,每个样品测定23 次,取平均值。Cu,Fe-N-C氧化物模拟酶的酶活性动力学研究,在100 L Cu,Fe-N-C(0.5 mg/
18、mL)和2 mL 8.0磷酸盐缓冲溶液中,加入不同浓度的OPD。充分混匀,室温孵育10 min后,在564 nm发射波长处测定荧光强度。典型的米氏方程模型:V1=+S1VmaxKmVmax1式中:V为反应速率;Km为米氏常数;Vmax为最大反应速率;S为底物OPD浓度。1.3.4 食品中PAEs的测定称取经粉碎混匀的样品10.00 g于玻璃锥形瓶中,加入50 mL正己烷,于50 水浴温度下,超声提取30 min,过滤不溶物,取滤液经旋转蒸发仪浓缩,水浴70 浓缩至溶液体积在1 mL以下,用乙腈定容至5 mL,经0.45 m微孔滤膜过滤,得样品测定液。1.4 数据处理除反应式用Chemdraw
19、Professional 16.0处理外,所有图片均用Origin 2019b进行加工处理。三线表利用Microsoft Office Word 2019绘制。检测标准曲线采用线性回归分析方法,以R2评估方法准确度。此外在样本中进行加标,取6 次测定值计算加标回收率验证方法的准确度和精密度。2 结果与分析2.1 Cu,Fe-N-C模拟酶的表征从Cu,Fe-N-C的透射电子显微镜图(图2a)可以看出,所制备的Cu,Fe-N-C呈现类球形,分散性较好,且尺寸大概在35 nm范围内,此外,高分辨透射电子显微镜图像显示了0.42 nm的晶面间距(图2b),对应石墨碳的(002)面(图2b)30。图2c
20、为EDS元素分布图,图像显示C、N、O、Fe和Cu均匀分布于Cu,Fe-N-C纳米材料中。从图2dg可以看到5 个不同的特征峰,分别为C1s、N1s、O1s、Cu2p和Fe2p,表明该材料存在C、N、O、Cu和Fe元素;与Fe-N-C及Cu-N-C相比,Cu,Fe-N-C的Fe2p及Cu2p峰向更高的结合能方向移动,这归因于Fe及Cu与碳材料之间的电子离域30,电子离域也改变了金属的电子结构,使Fe和Cu物种均匀分布;N1s谱分解为位于(3980.4)、(399.40.4)、(400.80.4)eV和(402.00.4)eV的4 个峰,分别归属于吡啶N、FeN、吡咯N和石墨N的峰。在N1s的精
21、细X射线光电子能谱(图2g)中,Cu,Fe-N-C纳米酶的吡啶氮含量最高,石墨N 及吡咯N含量相近,氧化N和Fe/Cu-N含量相近。50 nm5 nm0.42 nmab200 nmCuFeNCFeNCCuHADDF200 nm200 nm200 nm200 nm200 nmc1 000 900800700600500400300200结合能/eVC1sN1sO1sFe2pCu2pd710720730740结合能/eVCu,Fe-N-CeFe-N-C930940950960结合能/eVCu,Fe-N-CCu-N-Cf安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.04 309406404402
22、400398396结合能/eV石墨烯N吡咯NFe/Cu-N吡啶Ng图 2 Cu,Fe-N-C的透射电子显微镜(a)、高分辨透射电子显微镜(b)、EDS元素分布(c)和X射线光电子能谱(dg)图Fig.2 TEM image(a),HRTEM image(b),elemental distribution map(c)and XPS spectrum(d-g)of Cu,Fe-N-C2.2 Cu,Fe-N-C拟氧化酶活性Cu,Fe-N-C拟氧化酶活性用典型的TMB、ABTS及OPD作底物,如图3所示。在没有H2O2存在的条件下,TMB和ABTS产物在波长652 nm及415 nm处有紫外特征吸收
23、峰,同时呈现深蓝色、绿色(图3a)。而OPD的氧化产物在421 nm的光激发下,发射出峰位于564 nm的黄色荧光(图3b)。这些证据表明Cu,Fe-N-C具有模拟氧化 酶活性。4005006007008000.00.51.01.52.0底物+Cu,Fe-N-C底物TMBABTS吸光度波长/nma40050060070080005001 0001 500b底物+Cu,Fe-N-C底物强度 波长/nmOPD图 3 Cu,Fe-N-C催化TMB和ABTS的紫外吸收图(a)和 OPD的发射谱图(b)Fig.3 UV-vis absorption spectra with substrates of
24、ABTS and TMB(a)and fluorescence emission spectra with substrate of OPD(b)in the catalysis of Cu,Fe-N-C为了更深入地了解Cu,Fe-N-C的拟氧化酶活性,以OPD为底物,分析其稳态动力学,记录不同OPD浓度和反应时间下的荧光强度,由Lineweaver-Burk方程(图4)得到了米氏常数Km和最大初始速率Vmax。Vmax指最大反应速率,即当酶的活性位点完全被底物占据时的反应速率;Km指反应速率达Vmax值一半时所需的底物浓度,表示酶对底物的亲和力,Km可以用来评价纳米酶的催化活性,反映了纳米酶
25、对相应底物的亲和力31-32。虽然Cu,Fe-N-C没有表现出显著的Vmax(2.90108 mol/(Ls),但其Km值(0.456 mmol/L)低于大多数已报道的模拟氧化酶,表明Cu,Fe-N-C对OPD具有很高的亲和力和模拟氧化酶的活性。0.30.01.63.24.86.40.61.8a1.51.20.9V/(10-8 mol/(Ls)OPD浓度/(mmol/L)y=-3.160 3710-8x2+4.344 23 10-8x+1.109 4610-9R2=0.993 1654812161030b2520151/V/(107(Ls)/mol)1/OPD浓度/(L/mmol)y=1.57
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