CIRBP对小鼠血管平滑肌...增殖及迁移的调控及机制研究_赵嘉琪.pdf
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1、中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023,39(2):204-211杂志网址:http:/CIRBP对小鼠血管平滑肌细胞增殖及迁移的调控及机制研究*赵嘉琪1,杨大春2,王强2,孙雄山2,杨永健1,2(1西南医科大学临床医学院,四川 泸州646000;2西部战区总医院心内科,四川 成都 610083)摘要 目的:探讨冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP)对小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及迁移过程的调控及机制。方法:将雄性C57BL/6J小鼠分为假手术对照组、假手术干扰组、颈总动脉损伤对照组和颈总动脉损伤干扰组,每组5只。造模后按照组别分别
2、用阴性对照腺病毒(AD-NC)和沉默CIRBP腺病毒(AD-CIRBPI)转染,28 d后观察 CIRBP表达及血管内膜的增生情况。将小鼠 VSMCs分为对照组和腺病毒沉默组,分别用 AD-NC和 AD-CIRBPI 转染细胞 48 h,然后加入激活雷帕霉素靶蛋白复合物 1(mTORC1)活性的胰岛素。通过 RT-qPCR 检测CIRBP 的 mRNA 表达,Western blot 检测 CIRBP、磷酸化核糖体蛋白 S6(p-S6Ser235/236)和磷酸化 4E 结合蛋白 1(p-4EBP1Thr37/46)蛋白水平变化,Ki67免疫荧光染色和CCK-8实验检测细胞增殖,划痕实验检测细
3、胞迁移,HE染色检测颈动脉内膜增生程度。结果:沉默CIRBP后,VSMCs的活力下降,Ki67阳性细胞比率降低,细胞迁移速度减慢,同时mTORC1活性下降。加入胰岛素恢复mTORC1活性后,细胞活力、Ki67阳性细胞率和细胞迁移速度下降幅度减弱。损伤小鼠颈总动脉内皮后CIRBP表达增加,体内干扰小鼠CIRBP表达后,小鼠血管内皮损伤后内膜增生程度减轻。结论:CIRBP通过mTORC1途径加强小鼠VSMCs增殖及迁移,促进小鼠血管损伤后血管内膜增生。关键词 血管平滑肌细胞;细胞增殖;细胞迁移;冷诱导RNA结合蛋白;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1中图分类号 R543.5;R363.2+1 文献标志
4、码 A doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.002Regulatory effect of cold-inducible RNA-binding protein on proliferation and migration of mouse vascular smooth muscle cells and its mechanismZHAO Jiaqi1,YANG Dachun2,WANG Qiang2,SUN Xiongshan2,YANG Yongjian1,2(1School of Clinical Medicine,Southwest Medica
5、l University,Luzhou 646000,China;2Department of Cardiovascular Medicine,The General Hospital of Western Theater Command,Chengdu 610083,China.E-mail:;)ABSTRACT AIM:To investigate the regulatory effect of cold-inducible RNA binding protein(CIRBP)on the proliferation and migration of mouse vascular smo
6、oth muscle cells(VSMCs),and to explore its mechanism.METHODS:Male C57BL/6J mice were divided into 4 groups:sham+adenovirus-negative control(AD-NC)group,sham+adenovirus-CIRBP inhibitor(AD-CIRBPI)group,carotid vascular injury+AD-NC group,and carotid vascular injury+AD-CIRBPI group,with 5 mice in each
7、group.After the injury model was established,the mice were transfected with AD-NC or AD-CIRBPI.The CIRBP expression and vascular intimal hyperplasia were measured at 28 d after injury.Mouse VSMCs were divided into AD-NC and AD-CIRBPI group.The cells of these two groups were transfected with AD-NC an
8、d AD-CIRBPI for 48 h,respectively.The activity of mammalian target of rapamycin complex 1(mTORC1)was restored by insulin.The mRNA expression of CIRBP was explored by RT-qPCR.The levels of CIRBP,phosphorylated ribosomal protein S6(p-S6Ser235/236)and phosphorylated 4E-binding protein 1(p-4EBP1Thr37/46
9、)were detected by Western blot.The cell proliferation was explored by Ki67 immunofluorescence staining and CCK-8 assay.The cell migration was determined by scratch test.The carotid intimal hyperplasia was determined by HE staining.RESULTS:The viability of VSMCs,the ratio of Ki67-positive cells,wound
10、-healing rate and the activity of mTORC1 were decreased after silencing of CIRBP.However,the inhibitory effects of CIRBP silencing on cell viability,ratio of Ki67-positive cells and wound-healing rate were attenuated af文章编号 1000-4718(2023)02-0204-08 收稿日期 2022-09-16 修回日期 2022-11-04*基金项目 国家自然科学基金资助项目(
11、No.82070289);四川省自然科学基金资助项目(No.2022NSFSC0820)通讯作者 杨永健 Tel:028-86571250;E-mail:;孙雄山 Tel:028-86571255;E-mail:204ter restoring the activity of mTORC1 by insulin.The expression of CIRBP was increased after mouse common carotid vascular injury.The vascular intimal hyperplasia was attenuated after interfer
12、ing with the expression of CIRBP in vivo.CONCLUSION:CIRBP promotes the proliferation and migration of mouse VSMCs,and vascular intimal hyperplasia after mouse common carotid vascular injury through the mTORC1 pathway.KEY WORDS vascular smooth muscle cells;cell proliferation;cell migration;cold-induc
13、ible RNA-binding protein;mammalian target of rapamycin complex 1在我国,患心血管病的人数在迅速增加,其中动脉粥样硬化性心血管病的患病率与死亡率逐年上升,并且有年轻化的趋势1-2。经皮冠脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)是主要解决方法,但术后血管再狭窄严重制约PCI的预后。血管内皮细胞受到机械损伤后,经过内皮剥落,血小板活化,促炎细胞因子和趋化因子的释放以及血管平滑肌细胞移动到内皮下等过程,最终使血管内膜增生,引起血管内再狭窄3。当前血管平滑肌细胞增殖的分子调控机制主要包括Ra
14、s/丝裂原活化蛋白激酶、Janus激酶/信号转导及转录激活因子等4,针对血管内再狭窄的治疗手段进步显著,但术后血管再狭窄的发生率仍有5%10%5,提示仍有未知的分子机制需要探索。冷 诱 导 RNA 结 合 蛋 白(cold-inducible RNA-binding protein,CIRBP)是一种冷休克相关蛋白,属于RNA结合蛋白家族,在冷应激等条件下可以促进翻译6。CIRBP能调控器官与组织细胞的生长、增殖和分化7、维持端粒酶活性8、抑制细胞凋亡9、促进炎症细胞因子的激活与释放10。多个研究表明CIRBP在心力衰竭和血管损伤等心血管疾病中有重要意义10-14,当血管受到各种损伤和病理因素
15、刺激时,血管平滑肌细胞会从分化状态转变为去分化状态,增殖异常活跃,并进一步向内膜迁移,导致内膜增生及参与动脉粥样硬化、肺动脉高压等心血管疾病的进展15。既往研究显示CIRBP在乳腺癌、黑色素瘤、垂体腺瘤和胰腺导管腺癌等肿瘤细胞中发挥促进肿瘤细胞增殖作用16-19。但是CIRBP对血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内膜增生引起血管内再狭窄的调控目前并不清楚。本研究通过机械损伤小鼠颈总动脉内皮的方法构建血管再狭窄模型,用腺病毒感染方法干扰CIRBP表达,探究CIRBP在小鼠VSMCs增殖、迁移和血管内膜增生中的作用机制,为PCI术后防治血管再狭窄提供参考资料。材料和方法1动物20只约 7周龄 SPF级
16、的雄性 C57BL/6J小鼠,重约25g(成都药康生物科技有限公司),许可证编号:SCXK(川)2020-034。小鼠先适应性培养1周,白天适当光照12 h,恒温通风,喂以水和食物。2细胞和主要试剂小鼠主动脉平滑肌细胞系MOVAS(深圳市豪地华拓生物科技有限公司);RT-qPCR实验试剂盒(TaKaRa);RT-qPCR实验所用的引物(成都擎科伟业生物技术有限公司);DMEM高糖培养液、0.25%胰蛋白酶及青霉素+链霉素双抗(HyClone);胎牛血清(Gibco);磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)、5%牛 血 清 白 蛋 白(bovine serum
17、 albumin,BSA)和CIRBP抗体(武汉三鹰生物科技有限公司);4E结合蛋白1(4E-binding protein 1,4EBP1)抗体、磷酸化4EBP1(phosphorylated 4EBP1,p-4EBP1Thr37/46)抗体、GAPDH 单克隆抗体、核糖体蛋白 S6(ribosomal protein S6,S6)抗体、磷酸化S6(phosphorylated S6,p-S6Ser235/236)抗体和山羊抗兔抗(Cell Signaling Technology);4,6-二脒基 2苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)和Ki-67
18、抗体(Bioss);重组人胰岛素(Solarbio);CIRBP腺病毒(上海吉凯基因有限公司);ECL 发光液(Millipore);细胞活力及毒性检测(CCK-8)试剂盒(Biosharp);苏木精-伊红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司)。3主要方法3.1VSMCs分组及干预用含1%双抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养VSMCs,将培养皿放在5%CO2、37 培养箱中。隔23 d更换一次培养液,当细胞增殖到90%左右用0.25%胰蛋白酶消化生长状态良好的细胞,并且按照1 21 4传代培养,选择对数生长期细胞进行实验。为观察CIRBP对细胞增殖和迁移的影响,根据预实验结果,将腺病毒复感
19、染指数(MOI)定为100,按照分组分别向细胞中加入阴性对照腺病毒(AD-NC)和沉默 CIRBP 腺病毒(AD-CIRBPI)(105247-1),继续培养 68 h,随后用PBS冲洗2遍,换成完全培养液继续共孵育48 h。为进一步探究CIRBP是否通过mTORC1调节VSMCs增殖及迁移,在沉默CIRBP表达后,向相应的组别中加入人重组胰岛素(5 mg/L)孵育24 h。2053.2RT-qPCR 测定 CIRBP 的 mRNA 表达用 RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,用基因相对定量法标准化各组RNA浓度,接着反转录为cDNA然后扩增反应。内参照-actin(NM_007393)的上游引
20、物序列为 5-CGTGAAAAGATGACCCAGATCA-3,下 游 引物 序 列 为 5-TGGTACGACCAGAGGCATACAG-3;CIRBP(NM_007705)的上游引物序列为 5-AGCTCGGGAGGGTCCTACAG-3,下 游 引 物 序 列 为5 GAGGGCTTTTACTCGTTGTGTGT-320。3.3Western blot检测细胞CIRBP蛋白表达及反映mTORC1活性的底物S6和4EBP1的磷酸化水平用全蛋白提取试剂盒提取VSMCs蛋白,用BSA试剂盒测定蛋白浓度。取适量的蛋白样品进行电泳,然后把蛋白转至相应孔径的聚偏二氟乙烯膜,用牛血清白蛋白或者5%脱脂
21、奶粉室温条件下封闭1 h,再加入对应的抗体(CIRBP、4EBP1、p-4EBP1Thr37/46、S6、p-S6Ser235/236和GAPDH,稀释比:1 1 000)4 孵育过夜。接着用缓冲液洗涤,然后加入山羊抗兔抗(稀释比:1 1 000),孵育1 h后,用缓冲液洗涤,接着加入ECL化学发光液显色,最后通过ImageJ分析条带。3.4CCK-8检测细胞活力用完全培养基将细胞配成含有2108/L的细胞悬液,铺板到96孔板中,每个孔加100 L,每组设置3个复孔。当细胞增殖到80%左右时每孔加入10 L CCK-8溶液,放到细胞培养箱内继续孵育2 h,用酶标仪检测450 nm处的吸光度(A
22、),比较不同组间的细胞活力。3.5Ki-67免疫荧光染色检测细胞增殖将爬片放入6孔板中,加入配制好的细胞悬液,进行干预后,倒掉培养液用PBS清洗3次,用5%BSA封闭30 min后加入抗Ki-67(稀释比:1 500),放入湿盒中4 孵育过夜,再次用PBS清洗3次后加入荧光抗(稀释比:1 500),避光条件下室温孵育1 h,PBS再次清洗后加DAPI染液避光室温孵育10 min,用PBS清洗甩干后,用抗荧光淬灭剂封片,显微镜采集图像,记录Ki-67阳性细胞率。3.6划痕实验检测细胞迁移速度使用记号笔在6孔板背面大约每隔1 cm均匀划一条竖线,每个孔划3条竖线。向6孔板中加入一定数量的细胞,按照
23、分组进行干预,待细胞增殖到90%左右用无菌的规格为100 L吸头垂直于竖线划一道痕,随后用PBS洗涤细胞3遍,立刻拍摄时间点为0 h的细胞,接着加入无血清培养液,放入细胞培养箱中培养,分别在12 h及24 h两个时点用光学显微镜拍照,以划痕的宽窄变化快慢测量细胞迁移率。3.7小鼠分组及颈总动脉内皮损伤模型的建立用0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉已经称了重的小鼠,然后将麻醉好的小鼠固定于手术台面上,把颈部毛发脱去后予以消毒处理,接着在颈正中做约1 cm的纵行切口,分离左颈总动脉,用粗糙导丝来回摩擦血管内皮后,迅速取出导丝,结扎导丝穿刺点,缝合消毒切口21。将小鼠分为损伤对照组、损伤转染
24、组、假手术对照组和假手术转染组,每组5只,损伤对照组和假手术对照组转染阴性对照腺病毒AD-NC,损伤转染组和假手术转染组转染腺病毒 AD-CIRBPI,在术后7、14和21 d通过尾静脉继续追加注射腺病毒;28 d后取出小鼠颈总动脉,标记按组分装。3.8HE染色将各组小鼠的血管取材,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片、染色、封片,拍照记录,观察对比血管结构及内膜增生程度。4统计学处理采用 GraphPad Prism 8.3.0 软件对数据进行绘图,采用 SPSS 21 软件分析数据。用均数标准差(meanSD)表示定量资料。选用独立样本 t检验进行两组间比较,选用单因素方差分析进行多组间比较。
25、以P0.05为差异有统计学意义。结果1对照组与腺病毒沉默组细胞中CIRBP表达比较通过RT-qPCR实验得到,与对照组相比,腺病毒沉默组中CIRBP的mRNA水平显著下降(P0.01),同时 Western blot实验显示,和对照组比较,腺病毒沉默组中的CIRBP蛋白表达亦显著降低(P0.05),见图1。2干扰 CIRBP 的表达后小鼠 VSMCs 增殖和迁移情况划痕实验结果显示,与对照组相比,干扰CIRBP表达后细胞划痕愈合速度减慢(P0.05),见图2A。Ki-67 免疫荧光染色显示,和对照组相比,干扰CIRBP表达显著降低Ki-67阳性细胞率(P0.05),见图2B。CCK-8实验检测
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