钙离子协同溶氧提高重组β-CGT酶的可溶性表达量.pdf
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1、研究论文钙离子协同溶氧提高重组-CGT酶的可溶性表达量周媛媛1,李兆丰12,顾正彪12,班宵逢12,(1.江南大学食品学院,江苏无锡2 1412 2;2.江南大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室,江苏无锡214122)摘要:环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,简称CCT酶)能够通过环化反应生成环糊精,但天然菌株发酵产酶的水平较低,使得环糊精的生产成本居高不下,因此旨在通过异源表达以及发酵优化策略来提高CGT酶的表达量。首先将来源于Bacillus xiaoxiensis STB08的cgt基因插入质粒pET-20b(+)中,在宿主菌Esche
2、richia coli BL21(DE3)中进行分泌表达,在适宜的培养基中发酵96 h后,胞外酶活为34.6 6 U/mL。然后对发酵条件进行优化,改变溶氧以及添加一定终浓度的Ca2+可使酶活提高到6 6.8 6 U/mL及8 3.15U/mL,且溶氧与Ca2+协同作用可使酶活提高到10 5.6 9U/mL,相比于优化发酵条件之前提高了2 0 4.93%。最后通过蛋白质定位分析及流式细胞分析对溶氧及添加Ca2+影响发酵水平的机理进行了研究。结果表明,较低的溶氧能够减少重组大肠杆菌包涵体的形成,且溶氧较低时细胞活性较高,但溶氧过低时菌体浓度太低,不能满足菌体正常生长及代谢的需求。而添加Ca2+能
3、够减少包涵体的形成,同时Ca2+对细胞有较好的保护作用,因此,在溶氧以及Ca2+的协同作用下,能够保证菌体的高生长浓度,且Ca+能够增加细胞透性并保护细胞,使得活细胞数目显著增多。该研究提高了CGT酶在大肠杆菌中的可溶性表达量,为该酶的工业化生产提供了新的策略及方法,也可为相关酶的发酵优化提供参考。关键词:环糊精葡萄糖基转移酶:异源表达:发酵优化;溶氧;钙离子中图分类号:Q555文章编号:16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)10-0 0 16-0 8洪雁12,程力12,李才明月*1,2DOl:10.12441/spyswjs.20220403001Ca2+Coordinated Dis
4、solved Oxygen to Improve SolubleExpression of Recombinant-CGTaseZHOU Yuanyuan,LI Zhaofeng2,GU Zhengbiaos,BA N Xiaofeng2,HONG Yan2,CHENG Lil2,LI Caiming.0*1,2(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.State Key Laboratoryof Food Science and Resources,Jiangnan Uni
5、versity,Wuxi 214122,China)Abstract:Cyclodextrin glycosyltransferase(CGTase)can generate cyclodextrin by cyclizationreaction;however,the production is limited in natural bacterial strains,which results in high costs forcyclodextrin production.Thus,the authors aimed to enhance the expression of CGTase
6、 byheterologous expression and fermentation optimization strategies.First,the cgt gene derived from收稿日期:2 0 2 2-0 4-0 3基金项目:国家自然科学基金项目(32 0 7 2 17 1)。*通信作者:李才明(198 4一),男,博士,教授,硕士研究生导师,主要从事淀粉生物技术研究。E-mail:c a i mi n g l i j i a n g n a n.e d u.c n16JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsS
7、ue 10 2023修回日期:2 0 2 2-0 6-0 3研究论文周媛媛,等:钙离子协同溶氧提高重组-CGT酶的可溶性表达量Bacillus xiaoxiensis STB08 was inserted into the plasmid pET-20b(+)and expressed in the host strainEscherichia coli BL21(DE3).After 96 h of fermentation in a suitable culture medium,the extracellularenzyme activity reached 34.66 U/mL.Sub
8、sequently,the fermentation conditions were optimized bychanging the dissolved oxygen and adding a certain final concentration of Cat,which led to anincrease in enzyme activity to 66.86 U/mL and 83.15 U/mL,respectively.Furthermore,thesynergistic effect of dissolved oxygen and Ca+increased the enzyme
9、activity to 105.69 U/mL,representing a 204.93%improvement compared to that before fermentation optimization.Finally,themechanism of dissolved oxygen and Ca2t addition on the fermentation level was studied by proteinlocalization analysis and flow cytometry.The results showed that the lower dissolved
10、oxygen couldreduce the formation of inclusion bodies in recombinant E.coli,with higher cellular activityobserved at lower dissolved oxygen levels.However,the excessively low dissolved oxygen resultedin insufficient cell density to meet the needs of normal bacterial growth and metabolism.The addition
11、of Ca+could reduce the formation of inclusion bodies and provide good cellular protection.Therefore,the synergistic effect of dissolved oxygen and Ca ensured a high growth concentration ofbacteria,and Ca2+increased cell permeability and protected the cells,resulting in a significantincrease in viabl
12、e cell count.This study improved the soluble expression of CGTase in E.coli,providing a new strategy and method for its industrial production,as well as serving a reference forthe fermentation optimization of the related enzymes.Keywords:cyclodextrin glucosyltransferase,heterologous expression,ferme
13、ntation optimization,dissolved oxygen,Ca+环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextringlycosyltransferase,简称CCT酶,EC 2.4.1.19)是从细菌细胞中得到的一类胞外酶,它是-淀粉酶大家族的关键成员-3。CGT酶共有AE5个结构域,能够催化4种不同类型的反应,分别为水解、歧化、环化和偶合反应,具有极大的应用价值 4-5,近年来,随着环糊精在食品、医药、化工、农业以及化妆品等领域的广泛应用,CGT酶成为研究的热点。目前已经发现多种能够天然生产CGT酶的菌种,大多数为细菌,包括Paenibacillus macerans、Ba c
14、 i l l u sstearothermophilus8 B.megateriuml9等。大部分来源的 CGT酶的热稳定性相对较低,而来源于B.xiaoxiensis STBO8的CGT酶的热稳定性较高(6 0 下的半衰期为12.5min)。工业上生产环糊精所使用的CGT酶主要来自天然芽孢杆菌,少量为基因工程菌1-I,相比野生菌在培养过程中容易感染杂菌、发生回复突变、发酵上清液中酶活单位低等特点,重组菌培养方式简便,上清液中酶活单位高,目的蛋白质所占比较大,都使得在发酵过程中制备 CGT酶的成本进一步降低。但 CGT 酶在发酵过程中,经常会遇到外源蛋白质形成包涵体、胞外表达量难以提高等问题,
15、限制了CGT酶的大规模生产以及在工业中的应用2。因此,有必要提高CGT酶的胞外表达量。在合适的宿主中外源表达cgt基因被认为是目前提高CGT酶产量的主要且有效的手段。大肠杆菌是实验室研究和工业生产首选的表达系统,因此使用大肠杆菌系统来表达重组蛋白质成为一种快速简单的方法。如Li等利用大肠杆菌系统表达P.macerans的CGT酶,诱导90 h时CGT酶活力可达22.5 UmLI。但目前胞外表达量还是较低,且对发酵条件(如溶氧、钙离子)影响大肠杆菌产酶的机理研究较少,同时有关溶氧以及钙离子对大肠杆菌产酶的协同作用未见报道。因此,有必要系统研究溶氧及钙离子对大肠杆菌发酵产酶的影响。作者将来源于B.
16、xiaoxiensis STB08的-CGT基因插入质粒pET-20b(+)中,在宿主菌EcoliBL21中进行分泌表达,对能够显著影响-CGT酶发酵生产的发酵条件(溶氧、钙离子)的影响机理进行了分析。食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第10 期RESEARCHARTICLEZHOU Yuanyuan,et al:Ca?+Coordinated Dissolved Oxygen to ImproveSoluble Expression of Recombinant-CGTase后的上清液即为不溶性包涵体。材料与方法1.4.5细胞透性分析重组大肠杆菌细胞透性的1.1材料与试剂菌种与质粒
17、:小溪芽孢杆菌B.xiaoxiensisSTB08、质粒pET-20b(+)、表达宿主E.coliBL21DE3)均由作者所在实验室传代并保藏。主要试剂:限制性内切酶 Nco I 和 BamH I、聚合酶、TDNA连接酶、胶回收试剂盒、琼脂糖:均购自TaKaRa(大连)公司;超级感受态制备试剂盒等试剂:均购自生工生物(上海)有限公司;各种培养基组分:购自Oxoid公司。1.2主要仪器AppliedBiosystemsProFlexPCR仪:美国ThermoFisher Scientific公司产品;Mini Protein3蛋白质电泳系统:美国Bio-Rad公司产品;T-6V可见分光光度计:南
18、京菲勒仪器有限公司产品;FACSAriaI流式细胞分选仪:美国碧迪公司产品。1.3培养基LB液体培养基组分(g/L):酵母粉5,胰蛋白陈10,NaCl10;LB固体培养基为在LB液体培养基中再添加1.5g/dL的琼脂粉。发酵培养基(组分g/L):玉米浆膏2 4,大豆蛋白陈6,葡萄糖2,麦芽糖4,KH,PO42.32,K,HP043H,0 16.43。1.4实验方法1.4.1重组-CGT酶的生产种子培养:将保存在超低温冰箱中的甘油管菌株解冻,混合均匀后使用移液枪吸取10 0 L至LB液体培养基中,然后在37发酵摇床中培养10 12 h。发酵培养:将得到的种子液使用移液枪吸取2 mL至发酵培养基中
19、,然后在 30 发酵摇床中培养96 h得到重组-CGT酶液。1.4.2-CGT酶环化活力的测定-CCT酶环化活力的测定参照李才明的方法。1.4.3菌体浓度的测定通过光密度(Opticaldensity)的大小来反映菌体数量,用OD6o0m表示。1.4.4重组 CGT酶的亚细胞定位重组 CGT酶的定位参照李兆丰的方法 15。胞外CGT酶:发酵结束后发酵液于4、10 0 0 0 r/min离心2 0 min,上清液即为胞外-CGT酶;不溶性包涵体:在分离出周质空间与胞内CGT酶的细胞碎片中加人1g/dLSDS-PACE上样缓冲液,并在沸水浴中煮沸10 min,离心18JOURNAL OF FOOD
20、 SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 10 2023测定参照李兆丰的方法 5。即发酵结束后的发酵液于410 0 0 0 r/min离心2 0 min,收集菌体,用PBS洗涤2 遍,稀释至一定浓度后加人10 mmol/LNPN,用荧光分光光度计测定荧光值,测定参数为:缝宽1nm、激发波长350 nm、发射波长42 0 nm。1.4.6流式细胞仪(FCM)分析对于FCM分析,参照文献 16 使用碘化丙啶(PI)以及羧基二乙酰荧光素(cFDA)双染的方法对细菌细胞进行染色,略有改动。首先将不同条件下的细胞于42 水浴中用cFDA避光染色30 min,接着用P
21、I进行染色,染色的细菌需在1 h内进行FCM分析。1.4.7数据处理使用Prismgraphpad8.0软件作图,使用SPSS26.0中的单因素方差分析(ANOVA)对数据进行显著性分析(P0.05),流式细胞数据使用Flowjo10软件分析作图。2结果与分析2.1重组大肠杆菌BL21/pET20b(+)-c g t 的构建与表达将来源于B.xiaoxiensis STBO8的cgt基因插人质粒pET-20b(+)中,在宿主菌E.coliBL21中成功分泌表达,得到基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-cgt,进行摇瓶发酵培养得到粗酶液。2.2童重组-CGT酶的摇瓶发酵
22、条件优化在TB培养基的基础上,经过对温度、发酵时间、pH、碳源、氮源等进行优化后,最终以玉米浆膏24g/L、大豆蛋白陈6 g/L、葡萄糖2 g/L、麦芽糖4g/L,KH,P04 2.32g/L、K,H P0 43H20 16.43g/L作为最优发酵培养基,在30,pH7.0条件下发酵96 h后胞外酶活达到34.6 6 U/mL,接着对能够显著影响-CGT酶发酵生产的发酵条件(溶氧、钙离子)进一步优化,并对其影响机理进行分析。2.2.1溶氧对重组-CGT酶摇瓶发酵的影响在摇瓶发酵阶段,溶氧的改变主要是通过控制摇瓶中的装液量变化。基于摇瓶发酵培养基优化结果,选取不同的装液量(30、50、7 0、1
23、0 0、12 0、150 mL),接种体积分数为4%,每隔12 h取样测定菌体浓度OD6oo 以及重组大肠杆菌的胞外酶活力,并对发酵结束后的胞外-CGT酶以及不溶性包涵体进行SDS-PAGE分析,探究不同的溶氧对重组-CGT酶摇瓶研究论文周媛媛,等:钙离子协同溶氧提高重组-CGT酶的可溶性表达量发酵的影响。如图1所示,当装液量较少(30、50 mL)即发酵液中的溶氧含量较高时,由于其传氧系数较高,重组大肠杆菌迅速生长,菌体浓度增长很快,其OD6o0最高,但在此条件下重组大肠杆菌的产酶水平却是最低的,推测可能是由于重组大肠杆菌的生长速度过快导致其形成了较多的不溶性包涵体,同时菌体生长速度过快也会
24、导致代谢物的大量积累,影响发酵体系的pH以及酶的稳定性等从而抑制菌体产酶,并且由于装液量较少,在发酵过程中也会增加发酵液的挥发,发酵过程中发酵液体积减少过多不利于菌体进行产物合成;装液量过多(150 mL)会使发酵液中的溶氧含量过低,无法满足菌体正常生长及代谢的需要,在此条件下菌体浓度过低,同时重组大肠杆菌的产酶水平也较低;而当装液量为7 0、100、12 0 m L时,重组大肠杆菌的菌体浓度0 D600处于较为适宜的水平,对应的产酶水平也较高,因此在能够维持重组大肠杆菌正常生长的情况下,尽可能避免其菌体快速生长是提高产酶水平的关键。同样,邹纯等发现在短小芽孢杆菌发酵中,尽可能避免其快速生长是
25、提高产酶的关键7。综合考虑重组大肠杆菌的生长繁殖以及产酶情况,选取菌体浓度适当且产酶水平较高的装液量10 0 mL作为最优装液量,发酵96 h后其胞外酶活达到6 6.8 6 U/mL。6.00 30 mL-50 mL-70 mL-100 mL120 mL-150 mL5.004.00Uu009o3.002.001.000Fig.1 Effects of dissolved oxygen on the growth and-CGTase production of recombinant E.coli对重组大肠杆菌的包涵体以及发酵结束的粗酶液进行SDS-PAGE分析,如图2 所示,分泌至胞外的酶
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