泛素特异性蛋白酶4对透明细胞肾细胞癌细胞增殖能力的影响.pdf
《泛素特异性蛋白酶4对透明细胞肾细胞癌细胞增殖能力的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《泛素特异性蛋白酶4对透明细胞肾细胞癌细胞增殖能力的影响.pdf(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、浙江医学2023年第45卷第15期论著郑巳年崔晓波陈嘉瑜颜华卿陈力李如兵泛素特异性蛋白酶4对透明细胞肾细胞癌细胞增殖能力的影响DOI:10.12056/j.issn.1006-2785.2023.45.15.2023-748基金项目:浙江省医药卫生科技计划项目(2023KY1035)作者单位:315000宁波市医疗中心李惠利医院泌尿外科(郑巳年、崔晓波、颜华卿、陈力、李如兵),手术室(陈嘉瑜)通信作者:李如兵,E-mail:【摘要】目的探讨人类泛素特异性蛋白酶 4(USP4)对透明细胞肾细胞癌(KIRC)细胞增殖能力的影响。方法从TCGA 数据库及GEO 数据库中下载KIRC 患者的基因表达及
2、临床信息资料,进行转化及整理;同时利用Ualcan、HPA 数据库等在线工具对数据库中的KIRC 患者进行进一步分析,研究 USP4 表达与KIRC 患者临床病理特征(包括TNM 分期和病理分级)以及生存预后的关系。在KIRC细胞株Caki-1、OSRC-2中转染USP4干扰和过表达质粒,通过平板克隆、细胞计数试剂盒8实验检测USP4对 KIRC细胞增殖能力的影响。结果生物信息学分析显示,USP4 在 KIRC 组织中的 mRNA 及蛋白表达水平均明显低于癌旁正常肾脏组织(均P0.05)。KIRC 组织中 USP4 mRNA 表达水平与患者肿瘤 T 分期、病理分期、组织学分级、总生存率、疾病特
3、异性生存率、无进展生存率均有关(均P0.05);与性别、年龄、N 分期、M 分期均无关(均P0.05)。细胞实验结果显示,USP4 蛋白在 Caki-1、OSRC-2 细胞中显著过表达,而过表达 USP4 会明显降低 Caki-1、OSRC-2 细胞增殖能力和克隆形成能力(均P0.05);敲低 USP4 会明显提高 Caki-1 细胞克隆形成能力(均P0.05)。结论USP4在KIRC组织中低表达,而过表达USP4可抑制KIRC细胞增殖能力。【关键词】泛素特异性蛋白酶4;透明细胞肾细胞癌;细胞增殖;泛素化Effect of ubiquitin specific protease 4 on ce
4、ll proliferation of kidney renal clear cell carcinomaZHENG Sinian,CUI Xiaobo,CHEN Jiayu,YAN Huaqing,CHEN Li,LI RubingFirst-authors address:Department of Urology,Ningbo Medical Center Lihuili Hospital,Ningbo 315000,ChinaCorresponding author:LI Rubing,E-mail:【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of
5、 human ubiquitin specific protease 4(USP4)on cell proliferation ofkidney renal clear cell carcinoma(KIRC).MethodsThe gene expression and clinical information of KIRC patients wereobtained from TCGA database and GEO database.The relationship of USP4 expression with clinicopathological featuresand of
6、KIRC and survival of patients were analyzed with online tools Ualcan and HPA database.Human KIRC Caki-1and OSRC-2 cells were transfected with USP4 overexpression or interference plasmids,respectively.The effects ofoverexpression or knockdown of USP4 on the proliferation ability,cloning ability of KI
7、RC cells were detected by cellcounting kit-8 method and plate cloning assay,respectively.ResultsBioinformatics analysis showed that the ex-pression levels of USP4 mRNA and protein in KIRC tissues was lower than that in corresponding adjacent tissues(allP0.05).The expression of USP4 protein in KIRC t
8、issues was correlated with T stage,pathological grade,histologicalgrade,overall survival,disease specific survival and progression-free survival(allP0.05),not correlated with gender,age,N stage,M stage of KIRC patients(allP0.05).Cell experiment results showed that USP4 protein was significantlyovere
9、xpressed in Caki-1 and OSRC-2 cells,and overexpression of USP4 significantly decreased the proliferation andclonogenesis ability of Caki-1 and OSRC-2 cells(bothP0.05).Knockdown of USP4 significantly improved the cloningability of Caki-1 cells(allP0.05).ConclusionUSP4 is underexpressed in KIRC,and ov
10、erexpression of USP4 can inhibitthe proliferation of KIRC cells.1592浙江医学2023年第45卷第15期肾细胞癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,其发病率占成人恶性肿瘤的2%3%,但致死率极高1。中国肿瘤登记年报资料显示,2015年我国新发肾细胞癌66.8 万例,死亡 23.4 万例,发病高峰年龄 5060 岁2。透明细胞肾细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)是肾细胞癌最常见的亚型,死亡率最高3。尽管局限性KIRC(T1T2期)患者经手术切除治疗后5年生存率约为93%,但是约60%的
11、患者初次诊断即为转移性 KIRC 或在病程中发生肿瘤复发及转移,而转移性KIRC患者的5年生存率仅为12%4。因此,探索KIRC发生、发展的分子机制,有助于确定新的治疗靶点,以延长患者的生存期。近年来研究发现,泛素-蛋白酶体途径在恶性肿瘤的形成过程中起重要作用5。泛素化-去泛素化稳态是导致 KIRC 发生、发展的重要因素6。去泛素化酶从靶蛋白中去除泛素化修饰,从而调节包括细胞周期进程、信号转导、转录调节和细胞凋亡在内的许多生物学过程7。泛素特异性蛋白酶是去泛素化酶的主要亚类,而人类泛素特异性蛋白酶4(ubiquitin specific protease 4,USP4)基因是泛素特异性蛋白酶家
12、族成员之一,它位于染色体带 3p21.3 上,由22个外显子组成8。研究表明,USP4可以通过去泛素化修饰重要蛋白质来调节各种信号通路,在肿瘤、免疫和RNA剪接等方面均有不同程度的影响9。然而,目前尚无研究证实USP4是否通过去泛素化修饰功能来参与KIRC发生、进展的调控。基于此,本研究利用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库和基因表达综合(gene expression omnibus,GEO)数据库中 KIRC 患者的基因表达和临床数据进行分析,探讨USP4对KIRC细胞增殖能力的影响,以期为KIRC的临床诊治提供新的思路。1材料和方法1.1材料
13、人KIRC细胞系Caki-1、OSRC-2均购自中国科学院上海细胞库。FBS、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司;过表达USP4的质粒、敲低USP4的质粒、对照质粒均购自苏州吉玛公司;Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司;PBS、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、硝酸纤维素膜、脱脂奶粉、辣根过氧化无梅标记羊抗人的IgG、电化学发光显影液、细胞计数试剂盒 8(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒、-肌动蛋白抗体、结晶紫均购自中国上海碧云天生物技术有限公司。1.2方法1.2.1生物信息学分析(1)利用 TIMER 2.0 数
14、据库(http:/timer.cistrome.org/)的Gene DE模块分析TCGA数据库关于USP4在KIRC、肾乳头状细胞癌(kidney renalpapillary cell carcinoma,KIRP)、肾嫌色细胞癌(kidneychromophobe,KICH)和癌旁正常肾脏组织之间的差异表达。(2)从TCGA数据库(https:/portal.gdc.cancer.gov)下载并提取 TCGA-KIRC 项目 STAR 流程的 TPM 格式数据,获得的数据中包含 613 例原发性 KIRC 组织和72 例正常肾脏组织,并以 USP4 mRNA 表达水平的中位数(4.77
15、log2TPM)为界,分为高表达组和低表达组。(3)利用 GEO 数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载包含KIRC组织及癌旁正常肾脏组织的数据集GSE53757,其中包含72例KIRC患者完整的临床资料。(4)利用 Ualcan 数据库(https:/ualean.path.uab.edu/analysis.html)提供的基因表达和生存曲线的图表,分析不同临床病理特征患者KIRC组织中USP4表达的差异。(5)从 HPA 数据库(https:/www.proteinatlas.org/)获取KIRC组织及正常癌旁组织中USP4蛋白的免疫组化染色数据。1
16、.2.2细胞培养与转染Caki-1、OSCR-2细胞置于含10%FBS 的 RPMI 1640 培养基中培养。所有细胞在37、5%CO2的培养箱中生长,取对数生长期的Caki-1、OSCR-2细胞,以3104个/孔的密度均匀接种至24孔板;待细胞生长融合度为 60%70%时,按照 Lipo-fectamine 2000说明书步骤将目的质粒、对照质粒转染细胞;转染培养48 h后收集细胞进行以下实验研究。1.2.3Caki-1、OSCR-2 细胞中 USP4 蛋白表达水平检测采用Western blot法。收集转染的Caki-1、OSCR-2细胞,用PBS溶液进行稀释,置于冰上预冷10 s;加入R
17、IPA 裂解液后提取总蛋白,利用 BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。将处理后的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并电转至聚偏二氟乙烯膜上,5%脱脂奶粉 37 封闭 2 h;经一抗 1 1 000 稀释后 4 孵育过夜,加入TBST洗膜3 min5次;然后用辣根过氧化物酶二抗1 3 000稀释后37 孵育1 h,最后在凝胶成像系统内成像得到蛋白条带,根据条带灰度值计算目的蛋白的表达水平。【Key words】Ubiquitin specific protease 4;Kidney renal clear cell carcinoma;Cell proliferation;Ubiquitinatio
18、n 1593浙江医学2023年第45卷第15期1.2.4Caki-1、OSCR-2细胞增殖能力检测(1)CCK-8法:将各组细胞以2 000个/孔的密度接种于96孔板,分别于培养 0、24、48、72 h 时加入 100 L 10%CCK-8试剂,温育3 h后,使用酶联仪测定450 nm波长处的吸光度(optical density,OD)值,并以0 h时OD值为参照,其余时间点 OD 值均与 0 h 时 OD 值相除得到增殖指数。(2)平板克隆实验:细胞转染24 h后,消化、收集细胞并将细胞铺至6孔板,每孔加入约800个细胞、4 mL完全培养基,在显微镜下观察呈单细胞悬液状态。置于37、5%
19、CO2培养箱中培养2周,每隔24 h观察细胞状态;当出现克隆时即弃去培养基,使用 PBS 洗涤细胞3次,4%多聚甲醛固定20 min,0.25%结晶紫染色20 min,干燥后在光镜下观察并统计克隆数,然后计算克隆指数。克隆指数为实验组克隆数目与对照组克隆数目的比值。1.2.5统计学处理采用SPSS 25.0统计软件。符合正态分布的计量资料组间比较采用两独立样本t检验;不符合正态分布的计量资料组间比较采用Wilcoxon秩和检验;计数资料组间比较采用 2检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1USP4在KIRC组织中的表达利用TIMER 2.0数据库分析显示,USP4在肾细胞癌各亚型(
20、KICH、KIRC、KIRP)组织中的mRNA表达水平均明显低于癌旁正常肾脏组织;其中KIRC组织中的USP4 mRNA表达水平差异最为显著,差异均有统计学意义(均P0.05),见图1A。利用GEO数据库、TCGA-KIRC数据库分析显示,USP4在KIRC组织中的mRNA表达水平均明显低于癌旁正常肾脏组织(均P0.05),见图1B、C。利用HPA 数据库中的免疫组化染色结果证实,USP4 在KIRC组织中的蛋白表达水平明显低于癌旁正常肾脏组织(P0.05),且USP4蛋白主要定位于细胞质或细胞膜,见图1D。654321USP4 mRNA表达水平(log2TPM)AaUSP4 mRNA表达水平
21、12.011.511.010.510.00GSE53757B癌旁正常肾脏组织KIRC组织癌旁正常肾脏组织KIRC组织65430USP4 mRNA表达水平TCGACD癌旁正常肾脏组织(强表达)KIRC组织(弱表达)注:USP4为泛素特异性蛋白酶4;KIRC为透明细胞肾细胞癌;KICH为肾嫌色细胞癌;KIRP为肾乳头状细胞癌;TCGA为癌症基因组图谱;GEO为基因表达综合图1生物信息学分析USP4在KIRC组织中的表达(A:TIMER 2.0数据库提供的KICH、KIRC、KIRP组织和癌旁正常肾脏组织中USP4 mRNA表达水平比较,aP0.01;B:GEO数据库提供的GSE53757数据集中K
22、IRC组织和癌旁正常肾脏组织中USP4 mRNA表达水平比较,aP0.01;C:TCGA数据库提供的KIRC组织和癌旁正常肾脏组织中USP4 mRNA表达水平比较,aP0.01;D:HPA数据库提供的癌旁正常肾脏组织和KIRC组织中USP4蛋白表达的比较,免疫组化染色,40)aKICH组织癌旁正常肾脏组织(对照KICH)KIRC组织癌旁正常肾脏组织(对照KIRC)KIRP组织癌旁正常肾脏组织(对照KIRP)aa 1594浙江医学2023年第45卷第15期2.2KIRC组织中USP4 mRNA表达水平与患者临床特征的关系KIRC组织中USP4 mRNA表达水平与患者T分期、病理分期、组织学分级、
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 特异性 蛋白酶 透明 细胞 癌细胞 增殖 能力 影响
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。