粗毛纤孔菌子实体提取物体外对癌细胞的抑制作用及化学成分分析.pdf
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1、 59 食用菌学报 2023.30(5):2023.05.粗毛纤孔菌子实体提取物体外对癌细胞的抑制作用及化学成分分析昝立峰1,2,郭海燕1,杨香瑜1,乔莉娟1(1邯郸学院生命科学与工程学院,河北 邯郸 056005;2邯郸学院食用菌研究所,河北 邯郸 056005)摘 要:采用 CCK-8法检测粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus)子实体乙酸乙酯萃取物(CM1)和乙醇分离物(CM2)对5种癌细胞(SGC-7901、MDA-MB-231、HeLa、NCI-H1299、HepG2)增殖的抑制作用。结果表明:在实验质量浓度范围内,与癌细胞作用48 h后,CM1的抑制作用弱于CM2,CM1抑
2、制SGC-7901、HeLa、MDA-MB-231细胞增殖的IC50分别为338.64、224.13、542.07 gmL-1;CM2抑制SGC-7901、HeLa、MDA-MB-231、HepG2、NCI-H1299细胞增殖的IC50分别为104.28、100.51、122.32、196.35、277.66 gmL-1。利用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间高分辨率质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术在正负离子模式下表征CM1和CM2的化学成分。从CM1中鉴定出26种化合物,从CM2中鉴定出30种化合物,CM1和CM2中存在24种相同的化合物。CM1和CM2的主要化学成分是多酚,其结构主要
3、由hispidin为骨架聚合或缩合而成,其中相对含量较高的化合物有osmundacetone、phellinin B、phaeolschidin A、phaeolschidin C、pinillidine、3,3-亚甲基双6-2-(3,4-二羟苯基)乙烯基-4-羟基-2氢-吡喃-2-酮、phelligridin D和phelliribsin A。本研究结果为粗毛纤孔菌子实体药效物质基础研究和开发利用提供参考。关键词:粗毛纤孔菌;抑制作用;超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间质谱;鉴定In Vitro Inhibitory Effect and Chemical Composition Anal
4、ysis of Extracts from Inonotus hispidus Fruiting BodiesZAN Lifeng1,2,GUO Haiyan1,YANG Xiangyu1,QIAO Lijuan1(1 School of Life Science and Engineering,Handan University,Handan 056005,Hebei,China;2 Institute of Edible Fungi,Handan 056005,Hebei,China)Abstract:Using cell counting kit-8(CCK-8),ethyl aceta
5、te extract(CM1)and ethanol isolate(CM2)of Inonotus hispidus fruiting bodies were evaluated for their inhibitory effects on the proliferation of five human tumor cell lines,including SGC-7901,MDA-MB-231,HeLa,NCI-H1299,and HepG2.UPLC-Q-TOF/MS were used to analyze chemical components in CM1 and CM2.The
6、 results showed that CM1 inhibited the proliferation of SGC-7901,MDA-MB-231,and HeLa cells at 48 h,with IC50 of 338.64,224.13,and 542.07 gmL-1,respectively.CM2 inhibited the proliferation of SGC-7901,MDA-MB-231,HeLa,HepG2 and NCI-H1299 cells at 48 h,with IC50 of 104.28,100.51,122.32,277.66 and 196.3
7、5 gmL-1,respectively.The inhibitory effect of CM1 was weaker than that of CM2.There were 26 compounds identified in 收稿日期:2023-02-01原稿;2023-04-20修改稿基金项目:河北省自然科学基金(C2019109043);河北省高等学校科学研究项目(ZC2023191);邯郸学院校级项目(2017211)作者简介:昝立峰(1980),男,博士,主要从事食药用菌化学成分及其生物活性研究。E-mail:tengfei007zlf 5969007 60 第 30 卷食 用
8、菌 学 报CM1 and 30 compounds identified in CM2,among which 24 compounds were detected in both CM1 and CM2.The main chemical components of CM1 and CM2 were polyphenols polymerized or condensed with hispidin as the skeleton,and compounds with high relative abundance in the extracts included osmundacetone
9、,phellinin B,phaeolschidin A,phaeolschidin C,pinillidine,3,3-methylene-bis6-2-(3,4-dihydroxystyryl)-4-hydroxy-2H-pyran-2-one,phelligridin D,and phelliribsin A.The research provided a reference for the research,development and application of active compounds in I.hispidus fruiting bodies.Key words:In
10、onotus hispidus;inhibitory activity;ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-light tandem mass spectrometry;identification粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus)隶属于担子菌门(Basidiomycota),锈革孔菌目(Hymenochaetales),锈革孔菌科(Hymenochaetaceae),纤孔菌属(Inonotus),分布于中国的东北、华北、西北地区,主要生长在活立木上,偶见生长在倒木上,为一年生木腐食药用真
11、菌1。粗毛纤孔菌在山东临清、河北承德和新疆阿克苏地区均有分布,主要寄生于40年以上的古桑树上2。经包海鹰等3本草考证,粗毛纤孔菌为古籍记载的“桑黄”,其子实体在夏秋出现,生长初期颜色为金黄、红黄至黄色,幼时可食用,成熟后颜色渐变为黄褐色、黄棕色,晚秋至冬季颜色变深至黑色4。唐代 千金翼方 中记载粗毛纤孔菌金色者具有逐饮化痰散结、止痛疗伤消肿之作用,主治癖饮积聚,腹痛金疮;其黄熟陈白者,止久泻,益气不饥;而黑者,主治女子漏下、赤白汁、血病、癥瘕积聚、阴痛、阴阳寒热、月水不调等5。现代研究表明,粗毛纤孔菌具有良好的抗肿瘤和增强免疫作用。粗毛纤孔菌子实体提取物对小白鼠肉瘤S180和艾氏癌具有良好的抑
12、制作用,从其子实体中分离到的2种多酚化合物Hispidin和Hispolon均对人单核细胞化学光反应和有丝分裂原诱导的大鼠淋巴细胞增殖具有抑制作用6-8。LI等9-10发现,粗毛纤孔菌石油醚提取物具有良好的抗肿瘤作用,其主要成分包括麦角甾醇和三萜类化合物,抗肿瘤作用主要通过调节能量、氨基酸和类固醇激素生物合成途径的表达来实现。目前已从粗毛纤孔菌子实体中分离鉴定出麦角甾体、三萜、多酚和核苷等多种活性成分11-13。ZAN等14从粗毛纤孔菌野生子实体中分离得到2种新的多酚化合物Inonotusin A和Inonotusin B,其中Inonotusin A对乳腺癌细胞具有良好的抑制作用,IC50为
13、19.6 molL-1。KOU等15从粗毛纤孔菌栽培子实体中分离鉴定出2种新的多酚化合物Inonophenol A、Inonophenol B及1种新的羊毛甾烷三萜Inonoterpene A,其中Inonophenol B具有促进PC-12细胞突起生长作用。YANG等16从粗毛纤孔菌野生子实体中分离得到1种新的多酚化合物(4S,5S)-4-羟基-3,5-甲氧基环己基-2-烯酮,其对HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用,IC50为7.9 gmL-1。粗毛纤孔菌子实体中的化学成分具有良好的生物活性,随着对药理活性的深入研究,其化学成分的快速鉴定成为亟待解决的问题。超高效液相联用四级杆串联飞行时
14、间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术具有灵敏度高、选择性强、扫描范围广等优势,已广泛应用于天然药物化学成分分析17。笔者采用CCK-8法分析粗毛纤孔菌乙酸乙酯萃取物和乙醇分离物对5种癌细胞的抑制作用,并结合UPLC-Q-TOF/MS技术快速分析鉴定其主要化学成分,为粗毛纤孔菌子实体药效物质基础研究和深加工利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料粗毛纤孔菌(I.hispidus)成熟期栽培子实体由临清清源正本生物医药科技有限公司提供,经吉林农业大学图力古尔教授鉴定。将子实体真空干燥后放置于38 备用。人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)、胃癌细胞株(SGC-7901)、宫颈癌细胞株(HeL
15、a)、非小细胞肺癌细胞株(NCI-H1299)、肝癌细胞株(HepG2)均购自中国科学院昆明细胞库。61 昝立峰,等:粗毛纤孔菌子实体提取物体外对癌细胞的抑制作用及化学成分分析第 5 期1.2 试剂和仪器DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶、PBS、CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;乙腈和甲酸(色谱级)购自美国Sigma公司;DM-130大孔吸附树脂购自北京英莱克科技发展有限公司;其余试剂均为分析纯。3111二氧化碳培养箱、MUTiskan FC 酶标仪(美国Thermo Fisher公司);DMI3000B荧光倒置显微镜(德国LEIC
16、A公司);Acquity UPLC-G2 QTOF 联用系统(美国Waters公司);N-1200B 旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社);Synergy超纯水系统(默瑞生物科技有限公司);TXG-D016手动中药切片铡刀(天喜控股集团有限公司)。1.3 样品制备取粗毛纤孔菌子实体切片(厚度24 mm)100 g,按照图1流程制备乙酸乙酯萃取物(CM1)和乙醇分离物(CM2)。图1 粗毛纤孔菌子实体乙酸乙酯萃取物(CM1)和乙醇分离物(CM2)制备流程图Fig.1 Flowchart of preparing ethyl acetate extract(CM1)and ethanol iso
17、late(CM2)from I.hispidus fruiting bodies1.4 粗毛纤孔菌不同提取物对5种癌细胞抑制作用的测定精密称取128 mg样品,加入1 mL DMSO溶解,超声助溶,配制成128 mgmL-1母液备用。采用完全培养基(RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液)在37、5%CO2条件下培养细胞,取对数生长期细胞制备成每毫升含有5104 个细胞的悬液用于后续实验。采用CCK-8法,按试剂盒说明书操作,检测粗毛纤孔菌子实体不同提取物对5种癌细胞的抑制作用。将细胞悬液接种于96孔板,每孔接种100 L,在37、5%CO2条件下培养。次日细胞贴壁后
18、 62 第 30 卷食 用 菌 学 报弃掉培养液,加入含粗毛纤孔菌子实体不同提取物的培养基,使其作用质量浓度分别为0、40、80、160、320、640 gmL-1,每个样品5个复孔,培养48 h后,吸去96孔板中的液体,每孔加入100 L的CCK-8反应液,培养2 h后,用酶标仪检测在450 nm处的吸光度值,计算细胞存活率。1.5 粗毛纤孔菌提取物化学成分分析分别取1 g CM1、CM2样品,用100200 mL甲醇超声溶解,过0.22 m滤膜,得到的样品溶液用UPLC-Q-TOF/MS分析。色谱条件:色谱柱为Waters BEH C18(100 mm2.1 mm,1.7 m);流动相为水
19、(A)和乙腈(B),梯度洗脱:5%B(02 min),5%100%B(250 min),100%B(5055 min),100%5%B(5555.1 min),5%B(55.160 min);流速0.3 mLmin-1;进样量10 L;柱温40。质谱条件:ESI-离子源,质量扫描范围m/z 501 500 Da;毛细管电压2.8 kV,样品锥孔电压80 V,提取锥孔电压4.0 V,源温120,脱溶剂温度300,锥孔气流速50 Lh-1,脱溶剂气流速600 Lh-1。1.6 数据分析细胞实验数据用Graphpad Prism 9.3 软件做非线性回归分析,并用EXCEL软件辅助计算IC50;采用
20、Mass Lynx V4.1软件对化合物的质谱数据进行分析,并结合PubChem和Lipidomics gateway数据库鉴定化合物结构。采用KingDraw软件绘制化合物的结构图和裂解规律图。2 结果与分析2.1 对5种癌细胞的体外抑制作用粗毛纤孔菌子实体乙酸乙酯萃取物(CM1)和乙醇分离物(CM2)对5种癌细胞的抑制作用见图2。在实验质量浓度范围内,CM1对肿瘤细胞的抑制作用弱于CM2,CM1抑制SGC-7901、HeLa、MDA-MB-231细胞的IC50分别是338.64、224.13、542.07 gmL-1。CM2的对SGC-7901、HeLa、MDA-MB-231抑制作用较强,
21、IC50分别为104.28、100.51、122.32 gmL-1,而对HepG 2、NCI-H1299细胞的IC50分别为 196.35、277.66 gmL-1。注:A.SCG-7901;B.HeLa;C.MDA-MB-231;D.HepG2;E.NCl-H1299。Notes:A.SCG-7901;B.HeLa;C.MDA-MB-231;D.HepG2;E.NCl-H1299.图2 粗毛纤孔菌子实体乙酸乙酯萃取物(CM1)和乙醇分离物(CM2)对5种癌细胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory activity of ethyl acetate extract(CM1)and eth
22、anol isolate(CM2)of I.hispidus on SGC-7901,MDA-MB-231,HeLa,HepG2 and NCI-H1299 cells 63 昝立峰,等:粗毛纤孔菌子实体提取物体外对癌细胞的抑制作用及化学成分分析第 5 期2.2 化学成分分析结果采用 UPLC-Q-TOF/MS技术对粗毛纤孔菌子实体乙酸乙酯萃取物(CM1)和乙醇分离物(CM2)进样定性分析。根据化合物的分子离子峰、分子式及MS2碎片裂解规律,并参考文献和在线数据库(PubChem和Lipidomics gateway),从CM1和CM2中鉴定出24种多酚化合物、6种脂肪酸和2种甾体化合物,其中
23、CM1中鉴定出26种化合物,CM2中鉴定出30种化合物,CM1和CM2中存在24种相同的化合物。多酚是CM1和CM2主要的化学成分,结构主要由Hispidin为骨架聚合或缩合而成。正负离子模式下的总离子基峰图如图3所示,粗毛纤孔菌子实体中吡喃酮多酚化合物含有多个酚羟基,呈弱酸性,在负离子模式下具有较高的离子化效率,负离子模式下MS2谱中主要产生m/z 245(C13H9O5-)、201(C12H9O3-)、159(C10H7O2-)和135(C7H3O3-)的典型碎片离子,化合物鉴定主要依据负离子模式,详细信息见表1。注:A为CM1负离子基峰图;B为正离子基峰图;C为CM2负离子基峰图;D为正
24、离子基峰图。Notes:A.CM1,negative ion mode;B.CM1,positive ion mode;C.CM2,negative ion mode;D.CM2,positive ion mode.图3 粗毛纤孔菌子实体乙酸乙酯萃取物(CM1)和乙醇分离物(CM2)正负离子模式下的离子基峰图Fig.3 Base peak intensity chromatograms of I.hispidus extracts CM1 and CM2 in positive and negative ion modes 64 第 30 卷食 用 菌 学 报表1 粗毛纤孔菌子实体乙酸乙酯萃取
25、物(CM1)和乙醇分离物(CM2)中鉴定出的化学成分Table 1 Chemical constituents identified in CM1 and CM2序号No.保留时间Retention time/min分子离子Molecular ion(m/z)分子式Molecular formula特征碎片Characteristicmass fragment化合物Compound存在部位Part15.69288.999 5C13H6O8245.061 2Phelligridin JCM226.23245.045 2C13H10O5159.043 1HispidinCM1、CM237.4532
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