白花前胡内生真菌的分离筛选及菌株bhqh-2的次级代谢产物研究.pdf
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1、doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.05.029白花前胡内生真菌的分离筛选及菌株 bhqh-2 的次级代谢产物研究张世凯,徐 清,刘 林,杨正友,赵凤春(山东农业大学 生命科学学院,泰安 271018)摘 要 研究从白花前胡中分离具有良好生物活性的菌株,为挖掘新的菌种资源和先导化合物提供基础。采用组织块分离法分离内生真菌,使用麦芽汁培养基进行菌株液体发酵,发酵液经乙酸乙酯萃取并浓缩后获得发酵粗提物。采用管碟法测定粗提物对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌 4 种细菌,以及禾谷镰刀菌、大丽轮枝菌、灰葡萄孢霉和白色念珠菌 4 种真菌的抑菌活性;
2、采用 MTT 法测定粗提物对人肺癌细胞 A549和人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 的细胞毒活性。采用形态观察结合核糖体转录间隔区序列(rDNA-ITS)对活性最好的 1 株真菌进行菌种鉴定并对其次级代谢产物进行分离纯化和鉴定。结果共分离获得 7 株内生真菌,其中有 4 株菌 bhqh-2、3、5、7 具有较好的生物活性,其粗提物对所有供试菌均具有抑制作用,对两种癌细胞的抑制率均达到95%以上。经鉴定,bhqh-2 菌株为棒曲霉菌株,从其发酵粗提物中分离纯化得到 6 个已知化合物。总之,白花前胡内生真菌的部分菌株表现出较好的生物活性,为其内生菌生物活性及代谢产物的研究提供依据。关键词 白花前
3、胡;内生真菌;抑菌活性;细胞毒性;次级代谢产物中图分类号 Q939.9文献标识码 A文章编号 2095-1736(2023)05-0029-06Isolation and screen of endophytic fungi from Peucedanum praeruptorumand secondary metabolites from strain bhqh-2ZHANG Shikai,XU Qing,LIU Lin,YANG Zhengyou,ZHAO Fengchun College of Life Science Shandong Agricultural University T
4、ai an 271018 China Abstract This study aims to isolate endophytes with good bioactivity from Peucedanum praeruptorum to provide a basis for the research and development of new drugs.The endophytic fungi were isolated by tissue block method and fermented in ME medium.The fermen-ted liquids were extra
5、cted by ethyl acetate and concentrated to obtain the crude extracts.The antimicrobial activities of the crude extracts against four bacteria Staphylococcus aureus Salmonella enteritidis Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli and four fungi Fusarium graminearum Verticillium dahliae Botrytis cine
6、rea and Candida albicans were determined by cup-plate method.The cytotoxicity against human lung cancer cell line A549 and human breast cancer cell line MDA-MB-231 was determined by MTT meth-od.Finally morphological observation combined with ribosomal internal transcription spacer sequence rDNA-ITS
7、was used to identi-fy one strain with potent activity and the secondary metabolites of the strain were isolated purified and identified.A total of 7 strains of endophytic fungi were isolated.Among them 4 strains bhqh-2 3 5 and 7 showed good biological activities and their crude extracts had inhibito
8、ry effects on all of the test bacteria and fungi and the inhibitory rates on the two kinds of cancer cells were more than 95%.Strain bhqh-2 was identified as Aspergillus aspergillus and 6 known compounds were isolated and purified from its crude ex-tract.In conclusion some P.praeruptorum associated
9、fungi showed good biological activity which provided a basis for the study of en-dophytic metabolites and their biological activities.Keywords Peucedanum praeruptorum endophytic fungi antimicrobial activity cytotoxicity secondary metabolites92第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40
10、No.5Oct.2023收稿日期:2022-08-16;最后修回日期:2022-09-29基金项目:国家自然科学基金项目(31901778)作者简介:张世凯,硕士研究生,研究方向为植物内生菌资源开发利用,E-mail:869707036 通信作者:赵凤春,博士,副教授,研究方向为微生物资源开发利用,E-mail:zhaofengchun 近年来,抗生素的耐药性已经成为威胁人类健康的最严重的挑战之一1。同时,癌症成为非传染性疾病引起的过早死亡的主要原因之一2。因此,寻找新的治疗感染和癌症的药物迫在眉睫。另一方面,现代农业中化学农药的滥用会对人类生态环境产生恶劣影响,还会导致病虫害抗性等问题。从微
11、生物的次级代谢产物中开发结构独特、活性显著的先导化合物现已成为人类寻找和开发新型农药的研究热点3。在过去的几十年里,植物内生真菌因具有产生多种次生代谢物的能力而受到广泛关注4。其所产生的天然产物具有多种生物活性,如抗菌、抗寄生虫、抗氧化、免疫抑制剂和抗癌活性等5-8。白花前胡(Peuceda-num praeruptorum)是伞形科(Umbellales)前胡属(Peu-cedanum)的多年生草本植物9,是我国一种传统中药材,具有散风清热、降气化痰的功效,临床上用于风热咳嗽痰多、痰热喘满、咳痰等10。研究表明,白花前胡中主要含有香豆素类化学成分,其类型包括简单香豆素、呋喃香豆素和吡喃香豆素
12、,此外还含有挥发油、甾醇和有机酸等化学成分11-12;这些成分具有多种良好的生物活性,如抗真菌、抗氧化、抗肿瘤和抗炎等13。一些药用植物内生菌因长时间与宿主协同进化,可产生某些与宿主植物相似或相同的代谢物质14。因此,从白花前胡内生菌中有望获得具有抗菌和抗肿瘤的生物活性物质。目前,关于白花前胡内生真菌的报道较少,为进一步开发利用该菌种资源,本研究对白花前胡内生菌进行分离,对其粗提物进行抗菌和抗肿瘤活性初筛,并进一步选取一株活性较好的菌株进行次级代谢产物研究。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植株、菌株及细胞 2020 年 10 月在山东省泰安市岱岳区桃花峪采集新鲜健康、生长旺盛的白花前胡,
13、植物样品采集后放入干净的聚乙烯袋中避光保存于 4 冰箱。金黄 色 葡 萄 球 菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923)、肠 炎 沙 门 氏 菌(Salmonella enteritidis ATCC 13076)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli ATCC 8739)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)等4 种细菌,禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、灰葡萄孢霉(Botrytis cine-rea)和白色念珠菌(Candida
14、albicans ATCC 10231)等 4种真菌,人肺癌细胞 A549 和人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 两种癌细胞均为实验室保存。1.1.2 试剂与仪器MTT 溶液。称取 0.1 g MTT 粉末,用 20 mL 磷酸盐缓冲液(PBS,10 mmol/L)溶解,0.22 m 滤膜过滤除菌,配好后放于棕色瓶中,于 4 冰箱避光保存。麦芽汁液体培养基(ME)。称取 20 g 生麦芽,加入适量去离子水煮沸 30 min,4 层脱脂棉纱布过滤,滤液中添加 20 g 蔗糖、1 g 蛋白胨,溶解后调整 pH 值为7.2,定容至 1 L,分装到锥形瓶中,121 高压蒸汽灭菌 20 min。绿豆培养
15、基。称取绿豆 20 g 洗净,加入适量去离子水煮沸 30 min,用 4 层脱脂棉纱布过滤,定容至 1 L,pH自然,分装到锥形瓶中,121 高压蒸汽灭菌 20 min。水琼脂。称取 1.5 g 琼脂粉,加去离子水定容至100 mL,转移至锥形瓶中,121 高压蒸汽灭菌20 min。半制备高效液相色谱仪 FL-H050GS(Agela Phe-nomenex 公 司);多 功 能 酶 标 仪 CLARIO star(BMG LABTECH 公司);台式全温振荡器 THZ-C-1(苏州市培英实验设备有限公司);光学显微镜 SK2009U8(深圳市赛克数码科技开发有限公司);二氧化碳培养箱HF15
16、1(上海力申科学仪器有限公司)。1.2 方法1.2.1 内生真菌的分离 采用组织块法进行内生真菌的分离15:将白花前胡样品用去离子水冲洗干净,用 0.05%Tween-20 溶液浸泡 60 s,然后用 5%次氯酸钠溶液浸泡 5 min,再用2.5%硫代硫酸钠溶液浸泡 10 min,最后用 70%乙醇浸泡 3 min。将样品用无菌水冲洗 3 次,切成 1 cm1 cm的小块,接种在含有双抗的 PDA 平板上(100 g/mL氨苄西林钠,50 g/mL 链霉素),取 100 L 最后一次冲洗的无菌水涂布于 PDA 平板上作为对照组,28 恒温培养箱培养 5 7 d。待植物组织表面长出菌丝时,采取尖
17、端菌丝挑取法,在新鲜 PDA 培养基上四区划线,反复分离纯化培养,直到纯化出单菌落。1.2.2 内生真菌的发酵及粗提物的制备将保藏的菌种于 PDA 固体培养基上进行活化,随后把长满菌丝的琼脂划分为 1 cm1 cm 的菌块,取 5块转接到 100 mL ME 中,28、180 r/min 恒温振荡培养 7 d,得到菌种发酵液。发酵液中加入等体积乙酸乙酯萃取两次,将上层萃取液合并进行旋转蒸发浓缩,得到粗提物,将粗提物称重后于-20 冰箱保存备用。1.2.3 粗提物的抑菌活性测定使用管碟法测定粗提物对病原细菌和病原真菌的抑制作用16,在培养皿中倒入 10 mL 的水琼脂,待其凝固后均匀放置 45
18、个牛津杯;随后将 150 L 的病原菌液(细菌菌悬液或真菌孢子液)和15 mL 融化后的固体培养基混合后倒入平板内(加入菌液前培养基需冷03第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023却至 50 左右,细菌使用 LB 培养基,真菌使用 PDA培养基),培养基凝固后取出牛津杯。实验组每孔加入50 L 粗提物溶液(20 mg/mL,甲醇溶解);抗细菌或抗真菌 阳 性 对 照 孔 加 入 50 L 氨 苄 西 林 钠 溶 液(10 mg/mL)或制霉素溶液(2 万单位/mL);阴性对照孔加入 50 L 甲醇
19、;37 静置培养 12 h(抗细菌实验)或 28 静置培养 57 d(抗真菌实验);采用十字交叉法测量抑菌圈直径,观察对病原菌的抑菌效果。菌液制备方法如下:将病原细菌于固体 LB 培养基上进行活化,用接种环挑取单菌落接种于 5 mL 液体LB 培养基中,37、180 r/min 恒温振荡培养 12 h,制得病原细菌悬液。将病原真菌于 PDA 固体培养基上进行活化,取 5 块 1 cm1 cm 的菌块,加入到 100 mL绿豆培养基中,28、180 r/min 恒温振荡培养 57 d,得到病原真菌孢子液。1.2.4 粗提物的细胞毒活性鉴定采用 MTT 法测定粗提物的细胞毒活性17。每孔加入 10
20、0 L 细 胞 稀 释 液(1 DMEM,10%FBS,4 000 cells/well),在 37、5%CO2的细胞培养箱中培养 20 h,每孔再添加 80 L 培养基,实验组加 20 L 粗提物稀释液(粗提物终浓度为 100 g/mL),阳性对照组加入 20 L 盐酸阿霉素(终浓度为 0.05 g/mL),阴性对照组加入 20 L 培养基;混匀后培养 48 h,吸出培养液,缓慢加入 200 L PBS 洗涤一次,然后每孔加入含 20%MTT 的培养液 100 L 培养 4 h,弃去培养液,每孔加入 150 L DMSO,振荡孵育 10 min,测定 570 nm下吸光度。另设置空白对照组,
21、孔中只含有培养基不含细胞。抑制率=(1-实验组 OD 值-空白对照组 OD 值阴性对照组 OD 值-空白对照组 OD 值)100%1.2.5 活性菌株鉴定将菌种接种至 PDA 培养基上培养 5 d,观察菌株的菌落和菌丝形态特征,使用光学显微镜,观察菌丝和分生孢子等显微形态。提取基因组 DNA,送至青岛睿博兴科公司进行内转录间隔区(ITS)测序,将所得的ITS 序列与 GenBank 网站中已知菌株的序列进行 Blast分析,从中获得与菌株 ITS 具有相似同源性典型菌株的 ITS 的序列,用 MEGA 7.0 软件构建系统发育树。1.2.6 活性菌株化合物分离鉴定对菌株活性最好的一株菌进行大规
22、模发酵,经过萃取、旋蒸浓缩得到粗提物浸膏。首先使用硅胶柱层析,以石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂,按照体积比石油醚乙酸乙酯为10 1、4 1、2 1、1 1、1 2的比例依次进行洗脱,对粗提物进行初步分离,后续利用 C18 反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20 柱层析及半制备 HPLC 等方法对次级代谢产物进行分离纯化。将单体化合物用500 L 氘代丙酮或氘代 DMSO 进行溶解,转移到干净的核磁管中,测定化合物的1H NMR 谱和13C NMR 谱,通过对比文献确定化合物的结构。2 结果与分析2.1 内生真菌的分离及粗提物的制备从新鲜健康白花前胡中分离出内生真菌 7 株,编号为 bhqh-
23、1bhqh-7,菌株形态如图 1 所示。图 1 7 株白花前胡内生真菌菌株形态图Figure 1 Morphology of 7 endophytic fungi strains ofPeucedanum praeruptorum各菌株发酵后制备粗提物,粗提物的产量、颜色和状态如表 1 所示。结果表明不同菌株粗提物产量存在较大的差异。bhqh-2、5、7 的菌落形态相似,其粗提物的产量也较高。其中 bhqh-2 的粗提物产量最高,为232.4 mg/100 mL,bhqh-7 和 bhqh-5 次 之,分 别 为213.8 和 195.2 mg/100 mL。表 1 7 株内生真菌粗提物产量及
24、特征Table 1 Yield and characteristic of crude extracts from7 endophytic fungi strains编号Number粗提物产量Yield of crude extract(mg/100 mL)颜色Colour状态Statebhqh-1137.5黄色块状bhqh-2232.4黑色膏状bhqh-3133.0棕色膏状bhqh-479.2棕色颗粒状bhqh-5195.2红棕色膏状bhqh-610.2棕色块状bhqh-7213.8红棕色膏状2.2 粗提物抑菌活性的测定通过管碟法测定 7 株白花前胡内生真菌粗提物对病原细菌和病原真菌的抑菌活
25、性。发酵粗提物对病原细菌的抑菌效果如表 2 所示,其中 bhqh-1、bhqh-2、bhqh-3、bhqh-5 和 bhqh-7 对 4 种细菌都有抑制效果,bhqh-2 的抑菌效果最好,对病原细菌的抑菌圈直径均在 30.0 mm 以上。13第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023表 2 7 种粗提物对病原细菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of 7 crude extracts on pathogenic bacteria菌株编号Strain No.抑菌圈直径
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