补肾益智方对SAMP8小鼠海马和内嗅皮层神经元修复及突触可塑性的影响.pdf
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1、4摇 参考文献1摇 中华医师协会神经内科分会认知障碍专业委员会中国血管性认知障碍诊治指南编写组 郾 2019 年中国血管性认知障碍诊治指南也J页.中华医学杂志,2019;99(35):2737鄄44郾2摇 魏丽娜,钟镝,陈洪苹,等 郾 血管性认知功能障碍发病机制的研究进展也J页.中风与神经疾病杂志,2019;36(3):286鄄8郾3摇 Nicolas CS,Amici M,Bortolotto ZA,et al.The role of JAK鄄STAT sig鄄naling within the CNS也J页.JAKSTAT,2013;2(1):e22925郾4摇 Tsurumi A,Zha
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8、 ischemia鄄reperfusion injury via modulating JAK2/STAT3pathway in rats after autogenous orthotropic liver transplantation也J页.Brain Res,2017;1657:202鄄7郾16摇 Quoc Trung L,Espinoza JL,Takami A,et al.Resveratrol induces cellcycle arrest and apoptosis in malignant NK cells via JAK2/STAT3pathway inhibition也
9、J页.PLoS One,2013;8(1):e55183郾也2022鄄07鄄19 修回页(编辑摇 李和旭)补肾益智方对 SAMP8 小鼠海马和内嗅皮层神经元修复及突触可塑性的影响张彩霞摇 周泰冰摇 陈丹丹摇 接琳琳摇 卢强摇 吴君摇(山东中医药高等专科学校,山东摇 烟台摇 264199)摇 摇 也摘摇 要页摇 目的摇 探讨补肾益智方对 7 月龄 SAMP8 小鼠海马区和内嗅皮层神经元修复和突触可塑性作用的影响。方法摇 将 90 只 SAMP8 小鼠随机分为模型组、补肾益智方低剂量组和补肾益智方高剂量组,每组 30 只。选择 30 只 SAMR1 小鼠作为对照组。分别将补肾益智方免煎颗粒配成低剂
10、量 2郾 68 g/(kgd)和高剂量 5郾 36 g/(kgd)浓度药液,模型组和对照组给予等量生理盐水灌胃。连续灌胃 42 d。应用免疫荧光染色、RT鄄聚合酶链反应(PCR)和 Western 印迹法分别检测各组海马区和内嗅皮层中生长相关蛋白(GAP)鄄43 和神经生长因子(NGF)表达变化。结果摇 与对照组比较,模型组海马区和内嗅皮层中 GAP鄄43 及 NGF 平均光密度值、mRNA 和蛋白表达均显著降低(P0郾 05,P0郾 01)。与模型组比较,补肾益智方低剂量组与高剂量组海马区和内嗅皮层中 GAP鄄43 及 NGF 平均光密度值、mRNA 和蛋白表达均显著增强(P0郾 05,P0
11、郾 05)。结论摇 补肾益智方可通过上调 SAMP8 小鼠海马区和内嗅皮层中 GAP鄄43 和 NGF 的平均光密度值、mRNA 和蛋白量,影响神经元修复和轴突可塑性,进而减轻 SAMP8 小鼠的空间学习记忆功能损伤。也关键词页摇 阿尔茨海默病;补肾益智方;海马区;内嗅皮层;突触也中图分类号页摇 R741郾 02摇 也文献标识码页摇 A摇 也文章编号页摇 1005鄄9202(2023)17鄄4240鄄07;doi:10郾 3969/j郾 issn郾 1005鄄9202郾 2023郾 17郾 040基金项目:山东省自然科学基金(ZR2020MH350);山东省中医药科技发展计划项目(201902
12、76)通信作者:吴君(1981鄄),男,博士,副教授,主要从事中药复方药理研究。第一作者:张彩霞(1986鄄),女,硕士,讲师,主要从事神经发育与神经退行性疾病研究。摇 摇 阿尔茨海默病(AD)是一种随着年龄增长认知功能逐渐下降最终导致死亡的神经退行性疾病,好发于65 岁以上的老年人也1页,目前尚无有效的治疗方法。中医认为 AD 的认知功能减退主要与老年衰惫、肾精失充有关。补肾类中药复方具有多靶点、多途径的优0424中国老年学杂志 2023 年 9 月第 43 卷势,在延缓脑组织的衰老、改善学习记忆障碍等能力方面有着独特的优势也2页。研究表明,连续补肾益智方灌胃的 AD 模型鼠,脑内兴奋性氨基
13、酸明显降低,而抑制性氨基酸 酌 氨基丁酸和甘氨酸的含量升高,有预防及缓解记忆力衰退的功效也3页。水迷宫实验表明,补肾益智方能显著提高 AD 模型鼠学习记忆能力也4页。生长相关蛋白(GAP)鄄43 和神经生长因子(NGF)均是与轴突生长、突触可塑性和神经修复密切相关的基因也5,6页。本研究拟通过观察补肾益智方对 7 月龄SAMP8 小鼠海马和内嗅皮层中 GAP鄄43 和 NGF 表达的影响,研究中药复方对神经元的作用机制,以期为中医中药防治 AD 的临床应用提供更多实验依据。1摇 材料与方法1郾 1摇 实验动物摇 7 月龄快速老化模型 SAMP8 雄性小鼠 90 只,7 月龄雄性 SAMR1 小
14、鼠 30 只,均购自北京华阜康生物科技有限公司,动物许可证号SCXK(京)2019鄄0008。SPF 级,动物实验室内通风良好,自然光照,室温(22依2)益。适应性喂养后进行灌胃试验。1郾 2摇 实验药物摇 补肾益智方:熟地黄 15 g、枸杞子20 g、山茱萸 12 g、盐益智仁 6 g、丹参 15 g、当归10 g、郁金10 g、石菖蒲10 g、川芎10 g、远志6 g 等,以上药物经山东天江药业制成免煎颗粒。补肾益智方剂量设定根据成人临床给药剂量 1郾 34 g/(kgd)的 2 倍、4 倍确立也7页,低剂量也2郾 68 g/(kgd)页、高剂量补肾益智方药液终浓度也5郾 36 g/(kg
15、d)页连续灌胃 6 w。药液配制完成后放置于 4 益冰箱冷藏备用,用前 37 益温水浴后摇匀。1郾 3摇实 验 试 剂 摇兔 抗 GAP鄄43 多 克 隆 抗 体(ab75810)和兔抗 NGF 多克隆抗体(ab52918)均购自 Abcam 公司;荧光素鄄5鄄异硫氰酸盐(FITC)标记羊抗兔 IgG(111鄄095鄄003)购自美国 Jackson ImmunoResearch;TRIzol(15596鄄026)购自美国 Invitrogen 公司;cDNA 第一链合成试剂盒(RR036B)购自日本TaKaRa,;One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT鄄聚合酶链
16、反应(PCR)Kit 域(SYBR Green)购自日本TaKaRa,生产批号:RR086B。1郾 4摇 给药与取材摇将 SAMP8 小鼠随机分成 3 组:模型组、补肾益智方低剂量组和补肾益智方高剂量组。对照组为同月龄 SAMR1 小鼠。补肾益智方低剂量 组 和 高 剂 量 分 别 给 予 小 鼠 终 浓 度 为2郾 68 g/(kgd)和5郾 36 g/(kgd)补肾益智方药液连续灌胃42 d。模型组和对照组均给予等量生理盐水灌服,乌拉坦麻醉。随机选取部分小鼠经心脏灌注 4%多聚甲醛固定,取小鼠大脑,制作石蜡切片,进行免疫荧光染色。一部分剥离小鼠海马和内嗅皮层,TRIzol 匀浆器冰上充分匀
17、浆,提取总 RNA,一部分提取小鼠海马和内嗅皮层总蛋白。1郾 5摇 免疫荧光染色摇 切片脱蜡,封闭内源性过氧化物酶;37 益封闭非特异性抗原。甩去多余血清,滴加一抗兔抗 GAP鄄43(1 颐150)或兔抗 NGF(1 颐200),将切片置于湿盒,孵育过夜(4 益)。滴加荧光二抗(1 颐400),37 益,避光孵育 50 min;4忆,6忆鄄二脒基鄄2鄄苯基吲哚(DAPI)核染,将切片置于暗盒,孵育 5 min。荧光防淬灭封片剂封片。激光共聚焦显微镜观察、摄片。1郾 6摇RT鄄PCR摇分别提取小鼠海马和内嗅皮层总RNA,进行 RT鄄PCR 实验,实验步骤参照 Zhou 等也8页。扩增条件:预变性
18、 95 益,5 min;变性 95 益,15 s,58 益退火20 s,延伸72 益,40 s,进行40 循环;95 益,8 min。引物序列:GAP鄄43 上游引物:5忆鄄GCTGT鄄GCTGTATGAGAAGAACC鄄3忆,下游:5忆鄄AATTTTGGT鄄CGCAGCCTTATGA鄄3忆;NGF 上游引物:5忆鄄GTCTGG鄄GCCCAATAAAGGTTTT鄄3忆,下游:5忆鄄GAAGTTTAGT鄄CCAGTGGGCTTC鄄3忆;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游引物:5忆鄄GAAGGTGGTGAAGCAGGCATCT鄄3忆,下游:5忆鄄CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG鄄3忆。
19、1郾 7摇 Western 印迹检测摇 分别提取小鼠海马和内嗅皮层组织总蛋白。十二烷基硫酸钠(SDS)鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),转膜,5%脱脂奶粉溶液室温封闭 60 min;一抗(兔抗 GAP鄄431 颐15 000 或兔抗NGF1 颐12 000),4 益 过夜;羊抗兔二抗(1 颐5 000)37 益摇床孵育 55 min;电化学发光(ECL)反应3 min,暗室胶片曝光。1郾 8摇统计学处理摇采用 SPSS20郾 0 软件进行 t 检验。采用 ImageJ 图像分析光密度值。2摇 结摇 果2郾 1摇 GAP鄄43 定位于海马和内嗅皮层区且补肾益智方灌胃后表达升高摇 各组大脑切片的海
20、马和内嗅皮层区中均可检测到 GAP鄄43 阳性细胞。与对照组比较,模型组海马区和内嗅皮层中 GAP鄄43 平均光密度值、mRNA 及蛋白表达明显降低(P 0郾 01,P 0郾 05)。与模型组比较,补肾益智方低剂量组与高剂量组海马区和内嗅皮层中 GAP鄄43 平均光密度值、mRNA 及蛋白表达均显著增强(P 0郾 01,P 0郾 05)。见图 1、图 2、表 1、图 3、图 4。1424张彩霞等摇 补肾益智方对 SAMP8 小鼠海马和内嗅皮层神经元修复及突触可塑性的影响摇 第 17 期图 1摇 各组海马区 GAP鄄43 表达(免疫荧光,伊400)图 2摇 各组内嗅皮层 GAP鄄43 表达(免疫
21、荧光,伊400)2424中国老年学杂志 2023 年 9 月第 43 卷表 1摇 各组海马区及内嗅皮层 GAP鄄43 免疫阳性细胞平均光密度值、mRNA 和蛋白表达比较(x依s,n=10)组别海马区平均光密度值mRNA蛋白内嗅皮层平均光密度值mRNA蛋白对照组23郾 52依1郾 230郾 94依0郾 160郾 98依0郾 2022郾 39依3郾 310郾 87依0郾 151郾 21依0郾 23模型组19郾 39依1郾 442)0郾 69依0郾 142)0郾 74依0郾 181)18郾 17依2郾 871)0郾 56依0郾 092)0郾 89依0郾 201)补肾益智方低剂量组24郾 81依1郾
22、794)1郾 11依0郾 224)1郾 57依0郾 244)23郾 87依2郾 494)0郾 69依0郾 153)1郾 17依0郾 183)补肾益智方高剂量组25郾 64依2郾 634)1郾 17依0郾 214)1郾 88依0郾 254)25郾 90依1郾 574)0郾 80依0郾 194)1郾 20依0郾 203)摇 与对照组比较:1)P0郾 05,2)P0郾 01;与模型组比较:3)P0郾 05,4)P0郾 01;下表同1 4:对照组、模型组、补肾益智方低剂量组、补肾益智方高剂量组;图 4 同图 3摇 Western 印迹检验各组海马区 GAP鄄43 和NGF 蛋白表达2郾 2摇 NGF
23、定位于海马区且补肾益智方灌胃后表达升高摇 补肾益智方灌胃 42 d 后,各组海马区和内嗅皮层切片中均可检测到 NGF 阳性细胞。与对照组比较,模型组海马区和内嗅皮层中 NGF 平均光密度值、mRNA及蛋白表达均明显降低(P0郾 01,P0郾 05)。与模型组比较,补肾益智方低剂量组与高剂量组海马区和内嗅皮层中 NGF 平均光密度值、mRNA 及蛋白表达均显著增强(P0郾 01,P0郾 05)。见图 3 图 6、表 2。图 4摇 Western 印迹检验各组内嗅皮层 GAP鄄43 和NGF 蛋白表达图 5摇 各组海马区 NGF 表达(免疫荧光,伊400)3424张彩霞等摇 补肾益智方对 SAMP
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