不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶Suc2分泌表达水平的影响.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金青年基金项目()辽宁省科学研究项目()作者简介:王天琦 男硕士研究生 研究方向为分子生物学:.通讯作者 女教授博士博士生导师 研究方向为分子微生物与酶工程:.收稿日期:不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶 分泌表达水平的影响王天琦 王碧莹 付 彤 陈晓艺 李宪臻 杨 帆(大连工业大学 生物工程学院辽宁 大连)摘 要 目前绝大多数酿酒酵母()菌株利用菊糖生产乙醇的能力有限而蔗糖转化酶 是酿酒酵母水解菊糖的关键酶其分泌水平直接影响酿酒酵母转化菊糖为乙醇的性能 为提高酿酒酵母中蔗糖转化酶 的分泌表达水平利用生物信息学的分析方法选择出 种不同的分泌信号肽包括酿酒酵母内源性、其他菌株
2、来源以及已报道序列优化改造的信号肽将它们融合至 并构建了相应的酿酒酵母 重组菌 其中酿酒酵母内源分泌信号肽 能使蔗糖转化酶 更有效的分泌含有信号肽 的重组菌 的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活相对于含有天然信号肽的原始菌 分别提高 和其利用菊糖产乙醇能力较原始菌提高了 乙醇产量达到./在使用毕赤酵母()分泌信号肽 时蔗糖转化酶 的分泌水平也有提高含有信号肽 的重组菌 较原始菌 的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活分别提高了 和 同时利用菊糖产乙醇能力也提高了 产量达到./最后对重组菌 摇瓶发酵过程中的生物量、蔗糖酶酶活、残糖总量和乙醇产量进行了监测结果表明重组菌 的发酵性能较原始菌 有显著提高 本研究为提高蔗糖转化
3、酶 的分泌水平、构建高效菊糖基乙醇生产菌株提供参考关键词 酿酒酵母蔗糖转化酶 菊糖分泌水平分泌信号肽生物乙醇中图分类号.文献标识码 文章编号 ():./.(.)./.微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 ./.燃料乙醇作为一种清洁的生物质能源具有可再生及改善、保护生态环境的作用 以甘蔗、玉米为原料生产乙醇因争粮争地问题发展受到限制 而以纤维素为原料生产乙醇由于其预处理方法成本较高造成工业化生产进程缓慢研究发现富含菊糖的菊芋可以代替玉米淀粉生产乙醇且每吨乙醇的生产成本是利用淀粉生产成本的 菊糖是由 呋喃果糖通过 糖苷键相连而成的多聚果糖 目前仅有少数几种微生物可以利用菊糖生产乙醇并且生产乙醇能力有
4、限 酿酒酵母()具有其他菌株无法比拟的优点如产乙醇能力强、遗传操作平台成熟、抗逆性强、适合大规模生产是利用菊糖产乙醇的首选微生物 目前已有少数几种酿酒酵母被证明能够直接利用菊糖生产乙醇 而蔗糖转化酶 是这些酿酒酵母中分解代谢菊糖的关键水解酶 有研究表明隶属于糖苷水解酶 家族()的蔗糖转化酶 具有菊糖外切酶活力是这些酿酒酵母中分解代谢菊糖的关键水解酶 能够催化菊糖中呋喃果糖苷末端非还原性 呋喃果糖苷残基水解释放出的果糖可以转化为 二磷酸果糖进入糖酵解过程随后启动厌氧发酵生成乙醇研究表明酿酒酵母中蔗糖转化酶表达水平直接影响其转化菊糖产乙醇的效率 因此通过优化分泌表达途径来提高蔗糖转化酶 的分泌表达
5、效率对于提高酿酒酵母发酵菊糖产乙醇的能力至关重要 利用酿酒酵母分泌信号肽增强重组蛋白分泌表达水平是目前最有效的策略之一分泌信号肽位于分泌蛋白的 端由短链氨基酸组成并分为三个不同的区域:个氨基酸组成带正电荷的 端 个疏水氨基酸组成的 核心区 个能被信号肽酶切割的亲水氨基酸组成的 端 很多研究表明使用合适的分泌信号肽对细胞外分泌蛋白的表达至关重要 等使用酿酒酵母信号肽 将 葡聚糖苷酶 和里氏木霉内切葡聚糖酶 的细胞外活性提高至.倍和.倍并且 使毕赤酵母()中 的细胞外活性提高了.倍 等在酿酒酵母 中使用 的启动子和分泌信号肽融合 使其表达量显著提高并有效分泌至周质空间中 研究表明使用一些异源的分泌
6、信号肽也会使目的蛋白的表达量显著提高 等在酿酒酵母中表达人体溶菌酶 时利用人血清蛋白 的分泌信号肽可以很好的指导其分泌 此外还有研究通过对信号肽进行序列优化改造来实现蛋白质分泌水平的提高 等对 信 号 肽 中 个 位 点(、)进 行 突 变 优 化 后 的使两种漆酶 和 的分泌水平相较于未优化的 分别提高了 倍和 倍 为了使 更有效分泌到细胞外选择一种合适的分泌信号肽至关重要 对于不同的分泌信号肽宿主菌株内源的分泌信号肽是很有潜力的候选者因为它们可以保证被宿主的分泌表达系统所识别 已有研究表明 种源自酿酒酵母内源的分泌信号肽、和 能够有效介导酿酒酵母对不同蛋白的分泌另有研究表明来自于毕赤酵母和
7、解脂耶氏酵母的分泌信号肽、和 能够实现多种外源蛋白的高效表达如胰岛素前体、真菌防御素 等 此外近期研究成果还对天然信号肽一级结构进行了优化构建了新型分泌信号肽、和 这些序列均源自分泌蛋白或者质膜表达的蛋白 由此本研究选择 种不同来源的分泌信号肽进行生物信息学的初步筛选及预测随后使用 克隆 微 生 物 学 杂 志 卷()的策略将不同的分泌信号肽与蔗糖转化酶 融合对重组菌进行蛋白质分泌水平、酶活力、分泌效率以及乙醇产量进行分析期望获得菊糖基乙醇高效生产菌株 材料与方法.材料.菌株与质粒 、获赠于大连化学物理研究所赵宗宝研究员课题组 质粒 获赠于中国科学院青岛生物能源与过程研究所 本研究所构建的质粒
8、与重组菌株如表 所示表 本实验涉及的质粒与重组菌信息列表 菌株与质粒基因型质粒 融合有天然信号肽的 表达载体 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒 融合有 信号肽的 表达载体质粒菌株 含有 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质
9、粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌 含有质粒 的 重组菌.主要试剂与仪器设备 质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、山梨醇、蛋白胨等购自上海生工生物工程股份有限公司 酵母浸粉、琼脂粉购自 公司 氯化钠、异丙醇、无水乙酸钠、硫酸镁等购自天津市科密欧化学试剂有限公司 核酸染料购自北京赛百盛生物工程公司 菊糖购自上海蓝季科技发展有限公司 聚 合 酶、聚 合 酶、限制性内切酶(、)等购自大连 公司 其他常规试剂均为分析纯购自上海国药集团 梯度 仪(公司)电转仪(公司)凝胶成像分析系统(美国通用公司)微量分光光度计(美国通用公司)紫外分光光度计
10、(上海元析仪器有限公司)多功能酶标仪(公司)数字式全自动压力灭菌锅(日本 公司).方法.不同分泌信号肽序列的获取与引物的合成 本研究选择的酿酒酵母、解脂耶氏酵母和毕赤酵母的分泌信号肽序列 从 (:/./)和(:/./)获取人工合成及优化改造的分泌信号肽序列从文献中获取为了更好地构建重组载体所有序列均添加了载体和蔗糖转化酶 的一部分送至上海生工生物工程股份有限公司进行合成扩增带同源臂的不同信号肽序列所用引物使用 设计上游引物 序列()为 下游引物 序列()为 送至上海生工生物工程股份有限公司进行合成.生物信息学分析方法信号肽在线预测软件.(:/./)蛋白亲疏水性预测软件 在线软件(:/./).不
11、同分泌信号肽重组质粒的构建及鉴定 使用引物 和 扩增.合成的片段并使用胶回收试剂盒进行纯化 通过 克隆的方法将质粒 上 的原始分泌信号肽替换为目的分泌信号肽 通过电击转化的方法将重组质粒转化至大肠埃希菌 中挑取长势较好的单菌落进行菌落(菌落 引物 和)验证验证正确后送至吉林省库 期 王天琦等:不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶 分泌表达水平的影响 美生物科技有限公司测序鉴定.不同分泌信号肽重组菌的构建与鉴定将测序结果正确的重组质粒电击转化至酿酒酵母挑取长势较好的单菌落接入 后使用质粒提取试剂盒提取酿酒酵母质粒通过电击转化的方法转入大肠埃希菌 中挑取单菌落进行菌落(菌落 引物 和)验证验证正确后送至
12、吉林省库美生物科技有限公司测序鉴定.重组菌发酵培养方法 种子液培养方法:从平板挑取重组菌 环接种至 培养基中、/摇床培养 取 种子液接入 菊糖培养基中、/摇床培养 摇瓶发酵培养方法:取 种子液接入菊糖培养基中、/摇床培养并在发酵过程中分别于、取样.蔗糖转化酶 酶活力测定方法 研究表明蔗糖酶 同时具有菊糖外切酶活力因此基于已报道方法为了更加全面的考察 的水解活性本研究同时检测 对蔗糖和菊糖两种底物的活性 重组菌在 菊糖培养基发酵 时取样测定 的蔗糖酶活和菊糖酶活 酶活测定方法:使用./缓冲液(.)将发酵菌液稀释适当倍数取 稀释菌液与 蔗糖或菊糖底物(/.)混匀 反应 采用 法测定酶活重组菌的酶活
13、用还原糖含量表示 蔗糖酶及菊糖酶酶活定义:条件下每分钟水解 蔗糖或 菊糖释放 葡萄糖当量所需要的酶含量为 .分泌效率测定方法发酵液上清蔗糖酶活测定:重组菌在 菊糖培养基发酵 后取发酵液 离心 取发酵液上清液使用./缓冲液(.)稀释适当倍数后按照.方法测定蔗糖酶活 破碎细胞后上清蔗糖酶活测定:重组菌在 菊糖培养基发酵 后取发酵液 离心 弃发酵 液 上 清 后 加 入 等 体 积 缓 冲 液()重悬菌体后加入适量.酸洗玻璃珠利用组织破碎仪进行反复破碎直至 以上酿酒酵母被破碎 随后将破碎液 离心 取破碎液上清使用./缓冲液(.)稀释适当倍数后按照.方法测定蔗糖酶活 的分泌效率由重组菌发酵液上清蔗糖酶
14、活占重组菌总蔗糖酶活的比率来表征其中总蔗糖酶酶活为发酵液上清蔗糖酶活和破碎细胞后上清蔗糖酶活的总和 分泌效率计算具体见公式:分泌效率()()式中:为发酵液上清蔗糖酶酶活为破碎细胞后上清蔗糖酶酶活.重组菌 分析 接种重组菌至菊糖培养基 后收获发酵液浓缩进行 凝胶电泳电转移至 膜封闭液室温封闭 一抗为稀释后的 特异性抗体 过夜孵育室温下 洗 次每次 二抗为用 稀释的羊抗兔 孵育 室温下 洗 次每次 显色显色后用图像处理软件 对 结果进行灰度分析.发酵产乙醇能力的测定取发酵液上清过.滤膜所得滤液进行气相色谱检测气相色谱操作条件:色谱柱为安捷伦(.)顶空方法进行进样加热箱温度为 定量环温度为 传输线温
15、度为 样品瓶平衡时间为 进样持续时间为 循环 进样量 检测器温度 程序升温条件:保持 以 /升至 保持 .发酵液残糖总量测定方法 取 离心所得上清加入 ./溶液和 沸水浴 后加入 ./溶液混匀 采用 法测定还原糖浓度.生物量的测定采用比浊法测定生物量取 重悬发酵液加入 测定在 波长下的吸光值()结果与分析.不同分泌信号肽切割位点及疏水性分析首先从(:/./)和(:/./)数 微 生 物 学 杂 志 卷据库中获得 种不同蛋白的氨基酸序列 如表所示使用 .(:/./)预测以上蛋白氨基酸序列中分泌信号肽序列有实验证明分泌信号肽的疏水核心长度及疏水性也影响蛋白质的分泌表达强疏水性的分泌信号肽能够高效引
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