超声功率对小麦醇溶蛋白-膳食多酚共价复合物结构及功能性质的影响.pdf
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1、食品工程 食品科学 2023,Vol.44,No.19 65超声功率对小麦醇溶蛋白-膳食多酚共价复合物结构及功能性质的影响曹佳兴1,朱海兰2,王君荣1,张健豪3,张国治1,4,*(1.河南工业大学粮油食品学院,河南 郑州 450001;2.郑州科技学院食品科学与工程学院,河南 郑州 450001;3.上海交通大学农业与生物学院,上海 201100;4.河南省面制主食工程技术研究中心,河南 郑州 450001)摘 要:本研究选择自由基氧化反应诱导小麦醇溶蛋白(gliadin,GL)与表没食子儿茶素没食子酸酯进行共价反应,比较不同功率超声波(ultrasound,US)对共价反应强化效果的影响,旨
2、在提高多酚在蛋白质改性中的生物利用率。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱和Folin-Ciocalteu实验验证多酚的共价修饰。通过紫外光谱、圆二色光谱分析共价复合物的结构变化。结果表明:US破坏了蛋白质内部的弱作用力,引起分子结构解聚。蛋白质的亲水/疏水氨基酸残基转移,三级结构趋于松散,这一过程改变了分子表面的基团分布,提高了蛋白水溶性。此外,GL空间结构的转变暴露出更多的酶切位点,使其更容易被消化。本研究中,在US与自由基氧化的协同作用下,共价复合物中抗氧化分子的负载量增加,表现出更强的自由基清除活性。关键词:超声波;小麦醇溶蛋白;表没食子儿茶素没食子酸酯;蛋白结构;功能
3、特性Effect of Ultrasonic Power on the Structural and Functional Properties of Gliadin Protein-Dietary Polyphenol ConjugatesCAO Jiaxing1,ZHU Hailan2,WANG Junrong1,ZHANG Jianhao3,ZHANG Guozhi1,4,*(1.College of Cereal and Food,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;2.College of Food Scienc
4、e and Engineering,Zhengzhou University of Science and Technology,Zhengzhou 450001,China;3.School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 201100,China;4.Henan Province Wheat-Flour Staple Food Engineering Technology Research Centre,Zhengzhou 450001,China)Abstract:In this stud
5、y,free radical oxidation was chosen to induce covalent reaction of gliadin(GL)with epigallocatechin gallate.The effects of different ultrasound(US)powers on the enhancement of the covalent reaction were compared with the aim of improving the bioavailability of polyphenols in protein modification.Cov
6、alent modification of polyphenols was verified by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),high-performance liquid chromatography(HPLC)and the Folin-Ciocalteu assay.The structural changes of the covalent complexes were analyzed by ultraviolet(UV)spectroscopy and circular d
7、ichroism(CD)spectroscopy.The results showed that US disrupted weak intra-protein forces,which caused molecular depolymerization.The hydrophilic/hydrophobic amino acid residues of the protein were shifted and the tertiary structure tended to be looser,and this process altered the distribution of grou
8、ps on the molecule surface and increased the water solubility of the protein.Furthermore,the shift in the spatial structure of GL resulted in the exposure of more enzyme cleavage sites,making its digestion easier.The synergistic effect of US and free radical oxidation increased the loading of antiox
9、idant molecules onto the covalent complexes,resulting in stronger free radical scavenging activity.Keywords:ultrasound;gliadin;(-)-epigallo-catechin 3-gallate(EGCG);protein structure;functional propertiesDOI:10.7506/spkx1002-6630-20221226-249中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)19-0065-09引文格式:曹
10、佳兴,朱海兰,王君荣,等.超声功率对小麦醇溶蛋白-膳食多酚共价复合物结构及功能性质的影响J.食品科学,2023,44(19):65-73.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221226-249.http:/收稿日期:2022-12-26基金项目:河南省重大科技专项(151100111300);河南工业大学自科创新基金支持计划专项(2020ZKCJ20)第一作者简介:曹佳兴(1998)(ORCID:0000-0003-1815-9450),男,硕士研究生,研究方向为食品资源开发与利用。E-mail:*通信作者简介:张国治(1964)(ORCID:0000-0002-0817
11、-3067),男,教授,硕士,研究方向为食品资源开发与利用。E-mail:66 2023,Vol.44,No.19 食品科学 食品工程CAO Jiaxing,ZHU Hailan,WANG Junrong,et al.Effect of ultrasonic power on the structural and functional properties of gliadin protein-dietary polyphenol conjugatesJ.Food Science,2023,44(19):65-73.(in Chinese with English abstract)DOI:1
12、0.7506/spkx1002-6630-20221226-249.http:/为了维持动物蛋白与植物蛋白的消费平衡,提高食品生产的可持续性,近年来植物蛋白的研究备受关注,开发具有优良加工特性的植物蛋白成为现阶段的一大研究热点1。麸质蛋白是存在于小麦、黑麦、大麦、黑小麦以及燕麦等谷物中的贮藏蛋白,它对谷物类食品的品质有较大影响2。小麦中含有丰富的蛋白质资源,麸质蛋白质量占小麦籽粒干质量的10%15%,其中醇溶蛋白(gliadin,GL)相对含量为50%60%3。小麦GL是一种三维单肽链蛋白,分子质量集中在25100 kDa,分子内通过氢键、疏水相互作用以及静电相互作用连接4。GL具有两亲性和表
13、面活性,可作为活性分子的载体或稳定乳 液5;由于GL溶解度较低,消化性和抗氧化性较差,限制了其在工业生产中的应用。此外,GL中含有大量的谷氨酰胺和脯氨酸,其结构序列中包含大量抗原表位,这增加了接触/摄入而引发小麦不耐受症状的风险6。因此,GL的改性对于拓展麸质蛋白的应用具有重要意义。在食品工业中,通常使用烘焙、湿蒸、高压和 超声等加工方法来改善蛋白质的功能性质,但这些方法都存在一定的局限性,甚至可能导致蛋白质的加工性质劣变7。膳食多酚是存在于植物中的一种天然活性分子,具有良好的抗氧化性能和药理作用,常用于蛋白质功能特性的修饰。表没食子儿茶素没食子酸脂(()-epigallo-catechin
14、3-gallate,EGCG)是绿茶中含量最高、活性最强的儿茶素单体,由3 个苯环、1 个吡喃环和8 个酚羟基组成;这种独特的化学结构使EGCG具有比其他多酚更为优越的功能特性8。在碱性、自由基和酶促氧化环境中,EGCG可与蛋白质中的氨基、巯基、酪氨酸、脯氨酸等活性位点形成共价键。EGCG的共价修饰能有效改善蛋白质的理化特性,但传统共价反应(包括碱法、自由基法和酶促反应)效率较低、条件苛刻,使蛋白-多酚共价修饰在生产应用中存在较大的局限性。有研究发现,超声波(ultrasound,US)能使水分子解离产生OH,从而诱导蛋白质与多酚共价反应9-10。此外,US能促进GL空间结构的展开11,这为共
15、价反应提供了有利的条件。然而,US所提供的自由基氧化是瞬时的,并且受环境因素影响。此外,US处理功率与蛋白质空间构象以及分子间交联程度密切相关。因此,研究不同功率的US对共价反应产生的强化效果具有重要意义。本研究以H2O2/抗坏血酸作为诱发体系,诱导GL与EGCG共价反应,比较不同功率的超声环境中EGCG对GL的修饰强度;通过多光谱联用分析GL的结构变化,并对其功能特性进行表征,旨在寻找更高效的蛋白-多酚共价修饰方法。1 材料与方法1.1 材料与试剂小麦由河南省农业科学院提供。EGCG、2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothia
16、zoline-6-sulfonic acid),ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical,DPPH)上海麦克林生化科技有限公司;牛血清白蛋白 上海源叶生物科技有限公司;聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)试剂盒、上样缓冲液 上海雅酶生物医药科技有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶 美国Sigma公司。其他试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备凯氏定氮仪 山东还能科技仪器有限公司;F-4500荧光光谱仪 日本日立株式会社;圆二色光谱(circular dichroi
17、sm,CD)仪 美国Thermo Fisher公司;高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)仪 美国Agilent公司;UV-2600紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;蛋白垂直电泳仪、GS-900凝胶电泳成像系统 美国Bio-Rad公司。1.3 方法1.3.1 GL的分离与制备将小麦粉和乙醚按照1 3(m/V)的比例混合,室温下磁力搅拌4 h以去除脂肪,10 000 r/min离心10 min,弃上清液,重复上述操作3 次。将脱脂小麦粉和65%(体积分数,下同)乙醇溶液按照1 10(m/V)的比例混匀,在室温下机械搅拌提取24 h
18、以上,然后10 000 r/min离心15 min取上清液。对收集的上清液进行旋转蒸发处理,在20 冰箱静置后冻干。利用全自动凯氏定氮仪测定GL含量。1.3.2 共价复合物制备参照Xu Haoxie等12的方法,将抗坏血酸和H2O2溶于由65%乙醇溶液溶解的GL溶液,室温下搅拌(600 r/min、30 min)。然后将45.3 mg EGCG加入混合物中进行自由基反应,同时对反应体系进行超声处理(25、2 h),US功率分别为0 W及240、360、480、600 W,分别记作GE及GE-US(GE240、GE360、GE480、GE600);对照组(GL)不进行超声以及共价反应。反应结束后
19、使用截留分子质量为8 000 Da的透析袋透析72 h除去未反应的EGCG。所有样品30 减压浓缩后冻干处理,将制备的共价复合物于40 冰箱中保存。食品工程 食品科学 2023,Vol.44,No.19 671.3.3 十二烷基硫酸钠-PAGE分析十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)-PAGE参照Liu Xiangju等13的方法稍作修改。浓缩胶和分离胶质量分数分别为12.5%和5%,凝胶厚度为1.5 cm。使用超纯水溶解蛋白质样品,取适量样品溶液与4还原上样缓冲液/5非还原上样缓冲液混合,煮沸8 min使蛋白质变性,10 000 r/min离心5 min后收
20、集上清液上样。上样量为每孔15 L,调整电压80 V,待溴酚蓝指示剂移至分离胶,调整电压为120 V至电泳结束。电泳结束后使用考马斯亮蓝R-250进行染色,脱色后使用GS-900凝胶成像系统扫描分析。1.3.4 HPLC分析根据Ma Ling等14的方法进行HPLC分析。样品使用SDS溶液溶解后过0.45 m滤膜,过滤后注入2 mL样品瓶中。使用含0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的乙腈溶液(体积分数为20%)洗脱,流速为0.5 mL/min,检测波长设定为280 nm。1.3.5 多酚结合率测定参照金花等15的方法测定样品的多酚结合率,取0.5 mL样品溶液
21、与2.5 mL Folin-Ciocalteu试剂混合,避光反应5 min。加入2 mL 75 mg/mL Na2CO3溶液继续避光反应2 h,测定760 nm波长处的吸光度。以不同质量浓度的EGCG溶液绘制标准曲线,按照公式(1)计算多酚结合率。?100?/%?/?mg/mL?/?mg/mL?(1)1.3.6 游离巯基/酪氨酸含量测定使用Tris-Gly缓冲液溶解样品,得到5 mg/mL溶液。取3 mL样品溶液与0.03 mL ELLMA试剂(8 mg 5,5-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid),DTNB)溶解于2 mL Tr
22、is缓冲液中)迅速混匀,避光反应30 min,测定412 nm波长处的吸光度。按照公 式(2)计算游离巯基含量。73.53?A412 nm?/?nmol/mg?D(2)式中:D为稀释系数;为样品质量浓度/(mg/mL)。酪氨酸含量的测定参照Liu Fuguo等16的方法。将1 mL样品溶液(1 mg/mL)与1 mL硝酸混合,50 水浴加热15 min。冷却后加入4 mL无水乙醇和4 mL NaOH溶液(5 mol/L)混匀,分别测定360 nm和430 nm波长处吸光度。按照公式(3)计算酪氨酸含量。?/?ng/mg?0.535 7?A430 nm?0.371 4?A360 nm(3)1.3
23、.7 CD分析使用磷酸盐缓冲液(pH 7)溶解样品,使样品质量浓度为0.2 mg/mL。取适量样品溶液置于光程为0.5 mm的比色皿中,于190260 nm波长范围内在25、通氮气的 条件下扫描CD图谱。设置条件为:步长1 nm,单次扫描时间2 s,平行测定3 次。1.3.8 紫外光谱分析参考吕思瑶等17的方法,使用UV-2600紫外-可见分光光度计对样品进行紫外光谱采集。样品质量浓度为0.25 mg/mL。设置波长检测范围为255285 nm。以65%乙醇溶液作为参比溶液,平行采集3 次。1.3.9 溶解度测定准确称量100 mg样品,与5 mL超纯水混合,通过涡旋搅拌使样品分散均匀。在恒温
24、水浴摇床中振荡30 min后,10 000g离心收集上清液。取0.1 mL上清液加入5 mL考马斯亮蓝试剂,充分振荡混合,避光反应10 min后测定595 nm波长处的吸光度。以牛血清白蛋白绘制标准曲线,计算可溶性蛋白质量浓度,按式(4)计算水溶性。?100?/%?/?mg/mL?/?mg/mL?(4)1.3.10 表面疏水性测定参考王启明18的方法,使用溴酚蓝结合法测定样品的表面疏水性,溴酚蓝结合量越高,样品的表面疏水性越好。用超纯水溶解样品,取1 mL样品溶液(2.5 mg/mL)与1 mL磷酸盐缓冲液(pH 7)和200 L溴酚蓝溶液充分混合均匀,离心取上清液,测定595 nm波长处的吸
25、光度。按照公式(5)计算溴酚蓝结合量。?200?/g?A0?AA0(5)式中:A0和A分别为磷酸盐缓冲液和样品的吸光度。1.3.11 抗氧化性测定1.3.11.1 ABTS阳离子自由基清除能力将5 mL ABTS溶液(7.44 mmol/L)与88 L过硫酸钾溶液(2.6 mmol/L)混合均匀,静置18 h,作为ABTS阳离子自由基储备液。将储备液根据需要稀释,取2 mL样品溶液(2 mg/mL)与4 mL稀释后的ABTS阳离子自由基溶液避光反应10 min,测定734 nm波长处吸光度。以样品与过硫酸钾混合液作为空白对照,ABTS阳离子自由基清除率按照公式(6)计算。?100ABTS?/%
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