超高效液相色谱-质谱联用同时测定旋覆代赭汤中15种成分含量.pdf
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1、中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.9987DOI:10.19803/j.1672-8629.20220735 中图分类号:R927.1文献标志码:A 文章编号:1672-8629(2023)09-0987-05基金项目:河北省自然科学基金资助项目(H2022423335);河北省重点研发计划(20372502D);河北省中医药管理局项目(2020138)。作者简介:高乐,男,硕士,实验师,中药分析与质量控制。*通信作者:牛丽颖,女,教授 博导,中药分析与质量控制。E-mail:旋覆代赭汤是我国传统的中医方剂,为 古代经
2、典名方目录中第 2 首1。旋覆代赭汤出自于伤寒杂病论(汉 张仲景)2,是比较著名的理气剂,主要包含旋覆花、半夏、甘草、人参、代赭石、生姜、大枣7 味中药,能够降逆化痰、益气和胃。临床上主要用于胃气上逆引起的呃逆、噎膈、慢性胃炎及十二指肠球部溃疡等的治疗3-4。中药复方发挥药效作用与其不同药味之间化学成分共同作用有很大的关系,所以对旋覆代赭汤中多成分进行质量控制,对保证其质量和疗效具有重要意义。通过梳理文献,目超高效液相色谱-质谱联用同时测定旋覆代赭汤中 15 种成分含量高乐,王相,麻景梅,张泽昭,王鑫国,牛丽颖*(河北中医学院,河北省中药配方颗粒技术创新中心,中药材品质评价与标准化河北省工程研
3、究中心,河北 石家庄 050091)摘要:目的建立同时测定旋覆代赭汤中 15 种成分含量的超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)方法。方法采用 Shim-pack GIST C18(2.1 mm 100 mm,2.0 m)色谱柱,流动相用乙腈-0.1%甲酸,梯度洗脱,流速 0.3 mLmin-1,柱温 35。采用ESI源,以 MRM负离子模式检测。结果甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素、异甘草苷、芹糖异甘草苷、新甘草苷、绿原酸、隐绿原酸、阿魏酸、异绿原酸 A、异绿原酸 C、人参皂苷 Rb1、人参皂苷Re 和 6-姜辣素在各自浓度范围内线性关系良好(r0.998 6),平均回收率在 97
4、.0%103.1%,精密度、重复性、稳定性均符合要求。结论建立的方法简单、准确性好,可为旋覆代赭汤及其制剂的质量控制提供参考。关键词:超高效液相色谱-质谱联用;旋覆代赭汤;黄酮类;有机酸类;皂苷类;含量测定Simultaneous determination of fifteen components in Xuanfudaizhe decoction by UPLC-MS/MSGAO Le,WANG Xiang,MA Jingmei,ZHANG Zezhao,WANG Xinguo,NIU Liying*(Hebei University of Chinese Medicine,Hebei
5、Traditional Chinese Medicine Formula Granule Engineering&Technology Innovation Center,Hebei Engineering Research Center for Quality Evaluation&Standardization of Traditional Chinese Medicine,Shijiazhuang Hebei 050091,China)Abstract:Objective To establish a method for simultaneous determination of fi
6、fteen components in Xuanfudaizhe decoction by UPLC-MS/MS.Methods The separation was performed on a Shim-pack GIST C18 column(2.1 mm 100 mm,2.0 m)with acetonitrile-0.1%formic acid as the mobile phase under gradient elution at a flow rate of 0.3 mLmin-1.The column temperature was 35.The detection was
7、carried out via electrospray ionization(ESI).Multiple-reaction monitoring(MRM)scanning was used for quantification in a negative ion mode.Results Liquiritin,glycyrrhizic acid,liquiritigenin,isoliquiritigeni,isoliquiritin,isoliquiritin apioside,neoliquiritin,chlorogenic acid,cryptochlorogenic acid,fe
8、rulic acid,isochlorogenic acid A,isochlorogenic acid C,ginsenoside Rb1,ginsenoside Re and 6-gingerol had good linear relationships in their respective concentration ranges(r0.998 6).The average recovery ranged from 97.0%to 103.1%,and the precision,stability and repeatability of the method were good.
9、Conclusion This method is simple and accurate,which can provide reference for Xuanfudaizhe decoction and its preparations.Keywords:UPLC-MS/MS;Xuanfudaizhe decoction;flavonoids;organic acids;saponins;content determination前关于旋覆代赭汤的研究主要集中在药效机制和临床应用等方面,而对于其化学物质基础及质量控制等方面的研究还比较薄弱,主要是指纹图谱、煎煮工艺及少数几个成分的含量测定
10、研究5-8。含量测定在中药质量控制中起重要作用,而中药中化学成分的数量和种类既多又复杂,尤其是复方制剂,一般只建立几个指标的含量测定难以对药物质量进行有效控制。因此,建立多指标的质量控制,对保证中药的安全性和有效性有重要作用。随着时代的发展,超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)的方法由于具有灵敏度高和特异性强等特点,在中药多种成分分析中应用较为广泛 9-12。因此,本实验采用 UPLC-MS/MS 技术,建立同时测定旋覆代赭汤中 15 种成分含量的分析方法,为旋覆代赭汤及其复方制剂质量控制提供方法参考。基础与临床研究中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 Sep
11、tember,2023,Vol.20,No.99881 材料1.1 仪器超高效液相色谱仪(Shimadzu,型号:LC-30A型);三重四极杆线性离子阱质谱仪(SCIEX,型号:4500 QTRAP);电子分析天平(北京赛多利斯,型号:BSA224S-CW、CPA225D);超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,型号:KQ-250,功率 250 W,频率 40 kHz)。1.2 试药甘草苷(批号:111610-201908,95.0%)、甘草酸铵(批号:110731-202021,98.0%)、绿原酸(批号:110753-201817,96.8%)、阿魏酸(批号:110773-201614,9
12、9.0%)、6-姜辣素(批号:111833-201806,99.9%)、人参皂苷 Rb1(批号:110704-202129,94.3%)、人参皂苷Re(批号:110754-202129,96.0%)均购自中国食品药品检定研究院;甘草素(批号:17112302,98.0%)、芹糖异甘草苷(批号:18121104,98.0%)购自成都普菲德生物技术有限公司;异甘草素(批号:PS001032,98.0%)、异甘草苷(批号:PS012517,98.0%)、隐绿原酸(批号:PS001110,98.0%)、新甘草苷(批号:PS201105-01,97.0%)、异绿原酸 A(批号:PS012051,98.0
13、%)、异绿原酸 C(批号:PS011886,98.0%)购自成都普思生物科技股份有限公司;乙腈(Merck 公司,色谱纯);甲酸(Dikma,色谱纯)。处方中各药味由神威药业集团有限公司提供,经河北省药品检验研究院孙宝惠主任中药师鉴定为正品,符合中华人民共和国药典 标准(表 1)。2 方法与结果2.1 液质条件2.1.1 色谱条件 以 Shim-pack GIST C18(2.1 mm 100 mm,2 m)为色谱柱,流动相 A为乙腈,流动相B为 0.1%甲酸水,梯度洗脱(012 min,2%16%A;1231 min,16%70%A;3134 min,70%;3435 min,70%2%A)
14、。流速为 0.3 mL min1,柱温为 35,进样量为1 L。2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI),负离子检测,扫描方式为 MRM,喷雾电压为-4 500 V,雾化温度(TEM)为 550,喷雾气(GS1)和辅助气(GS2)均为 50 psi,气帘气(CUR)为 30 psi,碰撞气(CAD)为medium。各成分的质谱参数见表 2。2.2 对照品溶液的制备精密称取 15 个对照品适量,分别置于不同量瓶中,用甲醇制成各对照品储备液;精密量取各对照品储备液适量,置同一量瓶中,加 70%甲醇制成每1 mL约含甘草苷14 g、甘草酸46 g、甘草素 2 g、异甘草素1 g、异甘草苷 2 g
15、、芹糖异甘草苷 4 g、新甘草苷 2 g、绿原酸 4 g、隐绿原酸 2 g、阿魏酸3 g、异绿原酸 A 8 g、异绿原酸 C 4 g、人参皂苷Rb1 4 g、人参皂苷Re 4 g、6-姜辣素5 g的混合对照品储备液。2.3 旋覆代赭汤冻干粉的制备旋覆代赭汤原方为:旋覆花三两,人参二两,生表1 旋覆代赭汤药材信息Table 1 Information on medicinal materials of Xuanfudaizhe decoction药味药材名产地批号旋覆花INULAE FLOS河南安阳1709061、1709062、1709063、1709064山东平邑XFH180311、XFH1
16、80312、XFH180313山东德州XFH180321、XFH180322、XFH180323代赭石HAEMATITUM河北邯郸1710131、1710132、1710133、1710134山西太原DZS180311、DZS180312、DZS180313山西吕梁DZS180321、DZS180322、DZS180323人参GINSENG RADIX ET RHIZOMA吉林靖宇1709271、1709272、1709273、1709274吉林通化RS180311、RS180312、RS180313黑龙江RS180321、RS180322、RS180323甘草GLYCYRRHIZAE RAD
17、IX ET RHIZOMA甘肃陇西1804191、1804192、1804193、1804194新疆阿勒泰GC180311、GC180312、GC180313内蒙古鄂尔多斯GC180321、GC180322、GC180323大枣JUJUBAE FRUCTUS河北安国1709061、1709062、1709063、1709064河南安阳DZ180311、DZ180312、DZ180313河北沧州DZ180321、DZ180322、DZ180323生姜ZINGIBERIS RHIZOMARECENS山东平度SJ180401、SJ180402、SJ180403、SJ180404山东青州SJ18031
18、1、SJ180312、SJ180313山东莱芜SJ180321、SJ180322、SJ180323半夏PINELLIAE RHIZOMA四川清水1710201、1710202、1710203、1710204甘肃西河BX180311、BX180312、BX180313甘肃西昌BX180321、BX180322、BX180323中国药物警戒 第 20 卷第 9 期 2023 年 9 月 September,2023,Vol.20,No.9989姜五两,代赭一两,甘草三两(炙),半夏半升(洗),大枣十二枚(擘)。上七味,以水一斗,煮取六升,去滓,再煎取三升,温服一升,日三服2。经文献剂量和用法用量考
19、证13-16确定旋覆代赭汤的制备方法为取旋覆花 9 g、人参 6 g、生姜15 g、代赭石3 g、甘草(炙)9 g、半夏(洗)12 g、大枣12 g。以上 7 味药加水 2 000 mL,浸泡 30 min,煮沸,保持微沸煮至1 200 mL,200 目筛网过滤,滤液继续煮至 600 mL,冷冻干燥得旋覆代赭汤冻干粉。将“1.2”项下单味药材的 10 个批号(表 1)按照 EXCEL 中的 RAND 函数生成随机数,再排序得到随机批号。将处方中 7 味药的随机批号进行组合,制备10 批旋覆代赭汤冻干粉,编号为Y1Y10。2.4 供试品溶液的制备精密称取旋覆代赭汤冻干粉约 0.1 g,置具塞锥形
20、瓶中,加 70%甲醇 50 mL,称定质量,超声处理30 min,取出,放凉,称定质量,加 70%甲醇补足减失重量,摇匀,过 0.22 m 微孔滤膜。取续滤液加70%甲醇稀释10 倍,即得供试品溶液。2.5 方法学考察2.5.1 专属性考察 取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液(编号:Y3)各1 L,按“2.1”项条件检测。供试品显示与对照品保留时间相同的质谱峰且空白无干扰,表明专属性良好(图1)。2.5.2 线性关系考察 分别精密量取“2.2”项混合对照品储备液 0.3、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL,置 10 mL量瓶中,加 70%甲醇稀释至刻度,即得系列混合对照品溶液。按“2.1
21、”项条件检测。以浓度为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线(表 3)。2.5.3 精密度试验 取“2.2”项混合对照品溶液,按“2.1”项条件检测,连续测定 6 次,记录峰面积,计算各成分峰面积 RSD 分别为:甘草苷 2.4%、甘草酸1.5%、甘草素 3.7%、异甘草素 3.1%、异甘草苷 2.8%、芹糖异甘草苷 2.2%、新甘草苷 2.1%、绿原酸 4.0%、隐绿原酸 3.3%、阿魏酸 2.9%、异绿原酸 A 1.8%、异绿原酸 C 2.3%、人参皂苷 Rb1 2.3%、人参皂苷 Re 3.6%、6-姜辣素 2.0%,表明精密度良好。2.5.4 稳定性试验 取同一供试品溶液(
22、编号:Y3),分别在 0、2、4、10、16、24 h 按“2.1”项条件检测,记录峰面积,计算各成分峰面积 RSD 分别为:甘草苷2.0%、甘草酸 2.3%、甘草素 2.4%、异甘草素1.8%、异甘草苷 3.0%、芹糖异甘草苷1.0%、新甘草苷1.6%、绿原酸 2.7%、隐绿原酸 1.4%、阿魏酸 1.3%、异绿原酸 A 2.0%、异绿原酸 C 2.3%、人参皂苷 Rb1 1.1%、人参皂苷 Re 2.1%、6-姜辣素 2.4%,表明供试品在 24 h内稳定性良好。2.5.5 重复性试验 取同一供试品(编号:Y3)9 份,设置 0.05、0.10、0.15 g 3 个取样量,每个取样量各 3
23、 份,按“2.4”项下制备供试品溶液,按“2.1”项下条件检测,记录峰面积,计算各成分峰面积 RSD,结果 15个成分含量的 RSD 值均小于 3.3%(表 4),表明重复性良好。2.5.6 加样回收试验 取同一供试品(编号:Y3)9 份,每份约 0.05 g,分低、中、高 3 个水平,每个水平 3 份,按样品含有量的 50%、100%、150%精密加入一定量的 15 个对照品。按“2.4”项下制备供试品溶液,按“2.1”项下条件检测,计算加样回收率及 RSD 值。结果 15 个成分的平均加样回收率在 97.0%103.1%之间,RSD 均小于 3.0%(表 5),表明准确度良好。2.6 样品
24、含量测定 取 10 批样品,按“2.4”项下制备供试品溶液,按“2.1”项下条件检测,计算各成分的含量(表 6)。3 讨论旋覆代赭汤共含有 7 味药材,其化学成分较为复杂,有个别成分还是同分异构体,不易分离。通过查阅相关文献17-18,采用梯度洗脱的方式,先甲醇-水和乙腈-水 2 个流动相系统。结果表明,乙腈-水的分离效果优于甲醇-水。随后用乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱。结果显示加入 0.1%甲酸后色谱峰的峰形得到了很好的改善,分离效果良好。本研究用针泵进样的方法选择各成分的母离子和子离子,用相应的离子对筛选最优去簇电压(DP)和碰撞电压(CE)。经表 2 旋覆代赭汤中15 种成分的质谱参数Ta
25、ble 2 MS parameters of the 15 components in Xuanfudaizhe decoction成分母离子 m/z离子 m/z 解簇电压/V 碰撞能量/eV甘草苷417.2M-H255.0-134-29甘草酸821.4M-H350.8-206-55甘草素255.0M-H134.7-118-25异甘草素254.9M-H118.7-129-32异甘草苷417.2M-H254.7-152-33芹糖异甘草苷 549.1M-H254.8-169-40新甘草苷417.1M-H254.8-153-23绿原酸353.0M-H190.6-152-23隐绿原酸353.1M-H1
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