不同产地半夏指纹图谱的建立及化学模式识别研究.pdf
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1、天津中医药大学学报 第42卷第5期23年10月425Oct223摘要:目的建立半夏药材超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱,结合化学模式识别筛选差异性标志成分。方法采用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm100 mm,1.8 m),流动相为0.1%磷酸水-乙腈,梯度洗脱,流速为0.2 mL/min,进样体积为10 L,柱温为32 C,检测波长为260 nm。采用相似度评价和化学模式识别相结合的方法对其进行分析。结果在18批半夏UPLC指纹图谱中指认出15个共有峰,其中16批样品相似度均大于0.877,其余2批分别为0.606、0.778。聚类分析结果显示不同产地的半夏分为两大类
2、,主成分分析和聚类分析结果一致,采用正交偏最小二乘-判别分析筛选出6个差异性标志成分,通过对照品指认出3个成分(胞苷、次黄嘌呤、鸟苷)。结论建立的指纹图谱方法稳定、可靠、重复性好,结合化学模式识别,可为半夏质量评价提供参考。关键词:指纹图谱;半夏;化学模式识别;聚类分析;质量评价中图分类号:R284文献标志码:A文章编号:(23)050624-06不同产地半夏指纹图谱的建立及化学模式识别研究*魏淑婕1,张蒙蒙1,贾晓华1,欧阳慧子2,李天祥1,何俊1(1.天津中医药大学,组分中药国家重点实验室,天津301617;2.天津中医药大学第一附属医院,天津300381)*基金项目:天津市科技计划项目(
3、20ZYJDJC00120)。作者简介:魏淑婕(1998-),女,硕士研究生在读,主要从事中药学方向研究。通讯作者:何俊,E-mail:。引用格式:魏淑婕,张蒙蒙,贾晓华,等.不同产地半夏指纹图谱的建立及化学模式识别研究J.天津中医药大学学报,2023,42(5):624-629.DOI:10.11656/j.issn.1673-9043.2023.05.13半夏来源于天南星科多年生草本植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎,辛、温,有毒,归脾、胃、肺经1,具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功效2。半夏作为中药材始见于 五十二病方,后在 伤寒杂病论 中被广
4、泛使用。目前,因其具有抗肿瘤、降低血脂及抗新型冠状病毒感染等药理作用而备受关注,成为临床常用药材之一3-4。随着市场需求量不断增加,而半夏野生资源匮乏,存在市场缺口,人工栽培成为其替代途径,但人工栽培过程中存在栽培技术滞后、品种选育研究薄弱等问题5,导致市售半夏质量参差不齐、来源复杂,给临床用药带来诸多不便。如何利用现代分析方法控制半夏质量,是半夏药材研究进展中亟待解决的问题。中药所含化学成分多样复杂,单一或几个成分不能全面反映药材质量6,指纹图谱能够在整体层面表征药材化学成分,是一种综合、可量化的鉴别与评价手段7-9。化学模式识别技术可对中药指纹图谱信息进行深度挖掘,反映中药的内在成分差异,
5、对其质量控制具有重要意义10-12。因此,本研究采用超高效液相色谱(UPLC)法建立半夏药材指纹图谱,并运用SPSS和SIMCA软件进行化学模式识别分析,以期为半夏质量研究提供参考。1材料1.1仪器Agilent 1290 UPLC色谱仪(美国Agilent公司);Milli-Q IQ 7005超纯水制备仪(Millipore公司);5424R型高速控温离心机(德国Eppendorf公司);AS60/220.R2型十万分之一天平(波兰Radwag公司);G3KT18273型旋涡混合器(赛默飞世尔科技公司)。1.2试药对照品:胞苷(批号:DST190314-087)、次黄嘌呤(批号:DST190
6、407-087)、尿苷(批号:DST190108-024)、肌苷(批号:DST180521-028)、鸟苷(批号:DST190311-045)、腺苷(批号:2-ALI-112-1)均购自成都曼斯特生物科技有限公司;磷酸(色谱级)购自美国ROE公司;乙腈(色谱级)购自624天津中医药大学学报 第42卷第5期23年10月425Oct223表 1半夏药材样品信息样品编号产地采集时间S1贵州省毕节市赫章县2017年10月S2贵州省毕节市赫章县2017年10月S3贵州省毕节市纳雍县2017年10月S4甘肃省陇南市西和县2017年10月S5甘肃省陇南市西和县2017年10月S6甘肃省陇南市西和县2017年
7、10月S7甘肃省陇南市西和县2017年8月S8甘肃省天水市清水县2017年10月S9甘肃省天水市清水县2017年10月S10甘肃省天水市清水县2017年10月S11甘肃省天水市清水县2017年9月S12山西省运城市新绛县2017年10月S13湖北省荆州市2018年10月S14湖北省荆州市2018年10月S15河北省安国市2017年8月S16河北省石家庄市鹿泉区2018年10月S17河北省石家庄市鹿泉区2018年10月S18河北省石家庄市鹿泉区2018年10月美国Fisher公司;超纯水由Milli-Q超纯水制备仪制备。1.3药材半夏药材采自不同产区,样品去除泥沙与杂质,干燥,粉碎备用。具体样品
8、信息见表1,经天津中医药大学李天祥教授鉴定为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm100 mm,1.8 m);流动相:A相0.1%磷酸水,B相乙腈;梯度洗脱,洗脱梯度为:05 min,1%5%B;59 min,5%14%B;910 min,14%20%B;1014 min,20%45%B;流速:0.2 mL/min;进样体积:10 L;柱温:32 C;检测波长:260 nm。2.2对照品溶液的制备精密称取胞苷、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷对照品各5.0 m
9、g,加水溶解,配制成1 mg/mL的对照品溶液,置于4 冰箱储存备用。2.3供试品溶液的制备精密称取半夏粉末(过4号筛)1.0 g置于10 mL锥形瓶中,加水溶解定容至刻度线处,超声(功率250 W,频率50 kHz)提取30 min后取出,放至室温再次称取质量,补足失去的质量,用0.22 m滤膜过滤取续滤液,即得供试品溶液。2.4方法学考察2.4.1精密度实验取半夏样品(S9)粉末,精密称定1.0 g,按照“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液,在“2.1”项的色谱条件下连续进样6次,计算得到各共有峰保留时间RSD均小于0.1%,峰面积RSD小于1.7%,表明仪器精密度良好。2.4.2重复性
10、实验取半夏样品(S9)粉末,精密称定1.0 g,按照“2.3”项下的制备方法,平行制备6份供试品溶液,在“2.1”项的色谱条件下进样,计算得到各共有峰保留时间RSD小于1.5%,峰面积RSD小于5.9%,表明该方法重复性良好。2.4.3稳定性实验取半夏样品(S9)粉末,精密称定1.0 g,按照“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液,并在“2.1”项的色谱条件下分别于0、2、6、8、12、24 h进样分析,计算得到各共有峰保留时间RSD小于0.6%,峰面积RSD小于6.6%,表明样品在24 h内稳定性良好。2.5指纹图谱的建立分别称定18批半夏样品各1.0 g,按照“2.3”项下的制备方法制备供
11、试品溶液,并在“2.1”项的色谱条件下进样分析,得到UPLC指纹图谱。将色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”,生成18批供试品色谱图,其中共标定15个共有峰,通过对照品比对指认出6个色谱峰,分别为胞苷(3号峰)、次黄嘌呤(4号峰)、尿苷(6号峰)、肌苷(7号峰)、鸟苷(10号峰)、腺苷(12号峰),供试品色谱图及混合对照品图谱见图1。2.6相似度评价设置S1为参照图谱,采用平均数法,时间窗宽度为0.1,通过多点校正后进行整体相似度评价,相似度评价结果见表2。16批不同产地半夏药材相似度均大于0.877,其余2批样品指纹图谱与对照图谱相比相似度较低,其中
12、S12(山西省运城市新绛县)相似度为0.606,S16(河北省石家庄市鹿泉区)相似度为0.778。结果表明,大部分产地半夏样品指纹图谱的一致性较高,只有2批样品差异较大。2.7化学模式识别分析2.7.1聚类分析以18批不同产地半夏药材的15个共有峰面积为原始数据,经标准化处理后,导入SPSS 23.0软件,进行聚类分析。以平方欧式距离为测度,采用组间连接法,结果见图2。当类间距离为10时,18批样品被分为两组,其中S1S11、S13S15、S18聚为一类,S12、S16聚为一类。2.7.2主成分分析将18批半夏药材的UPLC指纹图谱在260 nm波长下的15个共有峰峰面积进625天津中医药大学
13、学报 第42卷第5期23年10月425Oct223图 218 批半夏样品的聚类分析树状图表 218 批半夏样品相似度评价结果编号相似度编号相似度S10.989S100.984S20.953S110.891S30.964S120.606S40.877S130.966S50.937S140.983S60.928S150.926S70.989S160.778S80.988S170.948S90.960S180.965注:A为18批半夏药材指纹图谱;B为混合对照品图谱。图 1供试品及混合对照品指纹图谱行标准化处理后,导入SIMCA 14.1软件,构建1815的原始数据矩阵,Par作为标度化方式,进行主
14、成分分析。从15个变量中提取出3个变量,累计方差贡献率为82.57,表明该模型的预测能力良好13,提取前3个主成分绘制PCA得分图,结果见图3。由图3可知,S1S11、S13S15、S18聚为一类,S12、S16聚为一类,与聚类分析结果一致。主成分分析载荷图中的点代表各共有峰,距离原点(0,0)越远,表明其权重越大,对样品质量差异影响越大14,见图4。由图4可知,3号峰(胞苷)、4号峰(次黄嘌呤)、5号峰、8号峰、10号峰(鸟苷)、12号峰(腺苷)、13号峰和15号峰是不同批次产生差异的主要原因,表明造成S12、S16与其他批次产生差异是上述多种成分协同作用的结果。2.7.3正交偏最小二乘法-
15、判别分析为了进一步分析不同批次半夏样品的批间差异性,采用SIMCA14.1软件在聚类分析和主成分分析的基础上对数据进行正交偏最小二乘-判别分析。正交偏最小二时间(min)时间(min)AB图 318 批半夏样品主成分分析得分图图 418 批半夏样品主成分分析载荷图信号(mV)信号(mV)626天津中医药大学学报 第42卷第5期23年10月425Oct223乘-判别分析得分见图5,结果可见18批样品被较好地分为两类。在建立的分析模型中,结实率参数R2X为0.691,区分参数R2Y为0.927,预测参数Q2为0.789,均大于0.5,说明模型稳定性和预测准确性良好15。随机改变分布变量Y的排列顺序
16、200次进行置换检验,得到置换检验图6,R2回归线在Y轴截距为0.217,Q2回归线在Y轴截距为-0.553,说明所建立的模型不存在过拟合现象,可用于判别分析18批样品的批间差异16。正交偏最小二乘-判别分析模型中变量重要性投影值(VIP值)可直观反映出各变量对样品分类的贡献值,筛选VIP值1.0的变量为差异性标志成分17,结果见图7。通过对照品指认,具有统计学意义的6个差异性标志成分的贡献程度依次为3号峰(胞苷)5号峰4号峰(次黄嘌呤)15号峰10号峰(鸟苷)8号峰,上述成分是S12、S16样品与其他批次样品之间产生差异的主要原因。在S12、S16样品中,3号峰、4号峰、5号峰和15号峰的峰
17、面积均大于其他批次样品,而10号峰的峰面积均小于其他批次样品。该结果与主成分分析中载荷图的分析结果基本一致。3讨论本研究考察了不同提取溶剂(水、70%甲醇、30%甲醇)、色谱柱类型(CORTECSC18柱、ACQUITYUPLCHSS T3柱)、流动相种类(乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-水、乙腈-水)及不同检测波长(210、254、260 nm)条件下样品分析时间、色谱峰峰形、峰数及峰响应的情况,确定采用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm100 mm,1.8 m),以乙腈-0.1%磷酸水为流动相,在260 nm检测波长下进行分析,所得色谱峰峰形良好,分析时间短。构建了半夏药材
18、UPLC指纹图谱,并对18批不同产地样品进行分析。共标定15个共有峰,其中指认6个色谱峰,分别为胞苷、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷及腺苷。相似度结果显示16批样品相似度均大于0.877,其余2批分别为0.606、0.778。聚类分析和主成分分析结果一致,大部分批次的样品具有较高一致性,只有2批样品与其他样品的差异较大。通过正交偏最小二乘-判别分析模型中的VIP值共筛选出6个差异性标志成分(经对照品比对指认出其中3种成分为胞苷、次黄嘌呤、鸟苷),是造成S12(山西省运城市新绛县)、S16(河北省石家庄市鹿泉区)与其他批次产生差异的主要原因。胞苷、次黄嘌呤、鸟苷所属的核苷类成分作为半夏中主要的一类成
19、分,已被证实是半夏“降逆止呕”的主要物质基础18。现代研究表明核苷类成分参与DNA代谢过程,具有抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性19。陈卫等20在不同炮制方法对半夏的差异性影响研究中发现,胸苷、次黄嘌呤和尿嘧啶的含量差异较为显著,可作为半夏不同炮制品有效区分的特征成分。王翠翠等18在对半夏及其混伪品的研究中发现,依据尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷4种核苷的含量可以很好地区分半夏、水半夏和虎掌南星。此外,图 518 批半夏样品正交偏最小二乘-判别分析得分图图 6正交偏最小二乘-判别分析模型的置换检验结果(n200)图 718 批半夏样品正交偏最小二乘-判别分析各成分 VIP 图()627天津中医药大学学报
20、 第42卷第5期23年10月425Oct223徐文英19对比了不同品种半夏中鸟苷和腺苷的含量,发现在不同品种半夏样品中两种成分的含量存在明显差异,认为核苷类成分对于评价半夏质量具有重要意义。本研究结果与上述研究结果较为一致,胞苷、次黄嘌呤、鸟苷的含量可以反映出不同产地半夏样品的差异性,且其所属的核苷类成分为半夏的主要药效物质,因此在对半夏的质量研究中应重点关注胞苷、次黄嘌呤、鸟苷等成分的含量变化。本研究建立了半夏药材的UPLC指纹图谱,结合聚类分析、主成分分析等化学模式识别方法进行综合分析,并采用正交偏最小二乘-判别分析筛选出不同产地半夏的差异性标志成分,可为半夏质量评价研究和资源开发利用提供
21、参考。参考文献:1国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020年版M.北京:中国医药科技出版社,2020:123-124.The National Pharmacopoeia Commission.Peoples repub鄄lic of China(PRC)pharmacopoeia:2020 editionM.Bei鄄jing:China Medical Science and Technology Press,2020:123-124.2黄凤英,高健美,龚其海.半夏药理作用及其毒性研究进展J.天然产物研究与开发,2020,32(10):1773-1781.HUANG F Y,GAO J
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- 不同 产地 半夏 指纹 图谱 建立 化学 模式识别 研究
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