hsa-let-7a-5p调控牙周膜干细胞增殖及凋亡.pdf
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1、张晔琳,昆明医科大学口腔医学院在读本科生。曾获“云南省级三好学生”“云南省级优秀学生干部”荣誉称号。研究方向为 miRNA 在牙周炎发病机制中的作用。主持国家级大学生创新创业训练计划项目 1 项。发表学术论文 2 篇,其中 SCI 收录论文 1 篇。hsa-let-7a-5p 调控牙周膜干细胞增殖及凋亡张晔琳1,2),马丽娅1,2),彭旭晖3),杨禾丰1,2),佘睿1,2,4)(1)昆明医科大学口腔医学院,云南 昆明650500;2)云南省口腔医学重点实验室,云南 昆明650500;3)永善县人民医院,云南 昭通657300;4)昆明医科大学口腔医院牙体牙髓科,云南 昆明650500)摘要 目
2、的探讨 hsa-let-7a-5p 对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖及凋亡的影响。方法将 let-7a-5p mimics、mimics nc、let-7a-5p inhibitor、inhibitor nc 转染进入 PDLSCs,通过 RT-qPCR测定转染效率,通过 CCK-8、细胞周期、EdU 实验检测 let-7a-5p 对 PDLSCs 增殖的影响,通过细胞凋亡实验检测 PDLSCs 的凋亡率。结果let-7a-5p 成功转染进入 PDLSCs。let-7a-5p mimics 可抑制 PDLSCs 增殖能力(P 0
3、.05),促进 PDLSCs 凋亡(P 0.01)。let-7a-5p inhibitor 可促进 PDLSCs 增殖能力(P 0.05),抑制 PDLSCs凋亡(P 0.01)。结论hsa-let-7a-5p 可抑制 PDLSCs 增殖,促进 PDLSCs 凋亡。关键词hsa-let-7a-5p;microRNA;牙周膜干细胞;增殖;凋亡中图分类号 R781.4 文献标志码 A 文章编号 2095 610X(2023)10 0047 08Hsa-let-7a-5p Regulates Proliferation and Apoptosis ofPeriodontal Ligament Ste
4、m CellsZHANG Yelin1,2),MA Liya1,2),PENG Xuhui3),YANG Hefeng1,2),SHE Rui1,2,4)(1)School of Stomatology,Kunming Medical University,Kunming Yunnan 650500;2)YunnanKey Laboratory of Stomatology,Kunming Yunnan 650500;3)Yongshan County Peoples Hospital,Zhaotong Yunnan 657300;4)Dept.of Endodontology,The Aff
5、iliated Stomatology Hospital ofKunming Medical University,Kunming Yunnan 650500,China)Abstract ObjectiveTo investigate the effect of hsa-let-7a-5p on the proliferation and apoptosis ofperiodontal ligament stem cells(PDLSCs).Methodslet-7a-5p mimics,mimics nc,let-7a-5p inhibitor,andinhibitor nc were t
6、ransfected into PDLSCs,and transfection efficiency was measured by RT-qPCR.The effects of let-7a-5p on PDLSCs proliferation were evaluated by CCK-8,cell cycle,and EdU experiments,while the apoptosisrate of PDLSCs was detected by apoptosis experiments.Resultslet-7a-5p was successfully transfected int
7、oPDLSCs.let-7a-5p mimics inhibited cell proliferation(P 0.05)and promoted cell apoptosis of PDLSCs(P 收稿日期20230813基金项目国家级大学生创新创业训练计划基金资助项目(202110678007);云南省教育厅科学研究基金指导性项目(42017002);云南省教育厅科学研究基金资助项目(2022Y216)作者简介张晔琳(2001),女,云南保山人,在读本科生。通信作者佘睿,E-mail:3116964506QQ.com昆明医科大学学报2023,44(10):4754JournalofKun
8、mingMedicalUniversityDOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S20231028CN531221/R0.01).let-7a-5p inhibitor promoted cell proliferation(P 0.05)and inhibited cell apoptosis of PDLSCs(P 0.01).Conclusionhsa-let-7a-5p can inhibit the proliferation of PDLSCs and promote the apoptosis of PDLSCs.Key words hsa-let-7a-5
9、p;microRNA;Periodontal ligament stem cell;Proliferation;Apoptosis牙周炎(Periodontitis)是指由菌斑生物膜引起的感染性牙周疾病,导致牙周支持组织破坏、牙周袋形成、牙槽骨吸收,最终牙齿松动脱落,是成年人失牙的重要原因之一 1。牙周炎不仅危害人类口腔健康,还与心血管疾病 2、糖尿病 3等全身性疾病有关联。牙周韧带组织中存在的一类具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞即牙 周 膜 干 细 胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),在特定的诱导环境下,可诱导分化成为牙周韧带组织、骨组
10、织、软骨组织、脂肪组织等 4。在炎症条件下,PDLSCs 的生理功能受到了影响 5。因此,探究 PDLSCs 生理功能的调控机制是研究牙周炎致病机理的重要环节之一。microRNA 是一类长度约为 22nt 的短序列非编码 RNA,其发挥作用的方式主要是通过在细胞胞质中与 Argonaute 蛋白家族结合形成 RNA 诱导沉 默 复 合 体(RNA-induced silencing complex,RISC),该复合体通过降解和翻译抑制两条途径作用于 mRNA 介导基因沉默 6。microRNA 参与了生物生长发育、细胞分化凋亡、肿瘤的形成转移等,并可作为慢性牙周炎的潜在诊断生物标志物,影响
11、其发生发展 7。其中,参与调控细胞生长分化的重要 miRNA(let-7a)似乎同样参与了牙周炎的进展。然而,其在牙周炎中的具体作用尚未完全明确,研究表明在牙周炎患者的牙龈组织中 let-7a 表达上调 89,而 let-7a-5p 在侵袭性牙周炎患者的唾液中下调 10。因此,为了进一步阐明 let-7a-5p 参与牙周炎进展的可能机制,本研究通过过表达/抑制 PDLSCs 中 let-7a-5p 的表达水平,探究其对 PDLSCs 增殖及凋亡的影响,旨在为阐明其在牙周炎中的调控机制提供思路。1材料与方法1.1试剂及设备-MEM 培养基、胎牛血清(FBS)、I 型胶原酶、0.25%胰蛋白酶、P
12、BS、双抗、riboFECT CPTransfection Kit(锐博生物,中国)、Cell CountingKit-8(美仑生物,中国)、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(美仑生物,中国)、Cell-Light EdUApollo488 In Vitro Kit(锐博生物,中国)、RNAisofor Small RNA(TaKaRa,日本)、PrimeScriptTM RTMaster Mix(Perfect Real Time,Takara,日本)、TBGreen Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus,Takara,日本)、BCA 蛋白检测试剂盒(Beyoti
13、me,中国)、细胞凋亡试剂盒(凯基,中国)、has-let-7a-5p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC合成自中国锐博生物科技有限公司。培养瓶、培养板(Corning,美国)、35 mm 激光共聚焦培养皿(NEST,中国)、洁净操作台(苏净净化设备公司,中国)、离心机、QuantStudioTMReal-Time PCR System、酶标仪、超低温冰箱、二氧化碳培养箱(Thermo,美国)、倒置相差显微镜(Leica,德国)、细胞计数仪(Countstar IC1000,中国)、TECHNE 梯度 PCR 仪(TECHNE,英国)、Quawell
14、 Q3000 微量紫外分光光度计(QUAWELL,美 国)、高 速 冷 冻 离 心 机(Eppendorf,德 国)、Agilent NovoCyte 流式细胞仪(Agilent Technologies,美国)、激光共聚焦显微镜(Nikon,日本)。本实验获昆明医科大学附属口腔医院医学伦理会批准(批准号:KYKQ2020MEC020)。在患者知情同意的情况下,于昆明医科大学口腔医院口腔颌面外科收集因为正畸治疗需要拔除的无疾病的年轻前磨牙,共 15 颗。1.2研究方法1.2.1牙周膜干细胞的原代培养按照课题组前期研究方法分离培养牙周膜干细胞11。酶消法消化牙周膜组织块,1000 r/min 离
15、心 2 min,弃上清。将含有牙周膜组织块的混悬液均匀接种于 25 cm2培养瓶,并加入 1 mL 20%FBS 的-MEM 培养基,于 37、5%CO2 恒温培养箱中培养。待细胞生长至 80%左右,胰酶消化,细胞传代。1.2.2hsa-let-7a-5p 转染以 1105个/孔的密度接种 PDLSCs 于 6 孔板中,待细胞融合至30%50%时利用 riboFECT CP Transfection Kit将 50 nM miRNA mimic,50 nM miRNA mimic nc,100 nM miRNA inhibitor,100 nM miRNA inhibitornc 转染至 PD
16、LSCs 中,将培养板置于 37、5%CO2恒温培养箱中培养以便进行后续实验。1.2.3RT-qPCR 测定转染效率转染 48 h 后利用 RNAiso for Small RNA 提取 miRNA,逆转录试剂盒逆转录成 cDNA,设计合成 hsa-let-7a-5p 引物(合成自广州锐博生物技术有限公司),RT-qPCR 检测基因表达,实验结果用 2-Ct法进行分析,U6 作为内参:forward primer(5-3)CTCGCTTCGGCAGCACA;reverse primer(5-3)AACGCTTCACGAATTTGCGT。1.2.4CCK-8 实验以 3103个/孔的密度接种48
17、昆明医科大学学报第 44 卷PDLSCs 于 96 孔培养板中,待细胞贴壁后,更换不含 FBS 的-MEM 培养基饥饿过夜。次日,按分组对细胞进行转染。细胞培养 07 d,每日同一时间,按 10 L/孔加入CCK-8 工作液,37 避光孵育 2 h,孵育结束后通过酶标仪在波长为450 nm 处测定 OD 值。1.2.5细胞周期以 1105个/孔的密度接种PDLSCs 于 6 孔板中,待细胞贴壁后更换不含FBS 的-MEM 培养基饥饿过夜。细胞融合至30%50%时按分组进行转染。48 h 后,收集细胞至离心管,PBS 洗涤,75%乙醇固定细胞 4静置过夜,固定完成后 PBS 洗涤细胞,2900
18、r/min离心 5 min 沉淀细胞,每个样品加入 500 L 染色工作液(按照说明书配置),避光、37 下继续孵育 0.5 h。24 h 内于流式细胞仪下将激发波长设置为 488 nm 对红色荧光及光散射情况进行检测。1.2.6EdU 实 验 以 1105个/孔 的 密 度 接 种PDLSCs 于激光共聚焦皿中,待细胞贴壁后,更换不含 FBS 的-MEM 培养基饥饿过夜。细胞融合至 30%50%时按分组进行转染。24 h 后进行EdU 标记即按 100 L/孔更换50 M EdU 培养基,继续孵育 24 h。24 h 后弃旧培养基,并使用 PBS洗涤细胞 2 次,按 50 L/孔的剂量加入已
19、配置好的细胞固定液,室温下孵育 30 min。配置 2 mg/mL的甘氨酸对过量醛基进行中和,PBS 洗涤细胞,含 0.5%TritonX-100 的 PBS 脱色摇床孵育,PBS洗涤细胞,按 500 L/孔加入1Apollo 染色反应液,避光室温摇床孵育 30 min,0.5%TritonX-100 的 PBS 清 洗 细 胞 3 次,DAPI 染 色 2 min,PBS 洗涤细胞 3 次,湿润状态下利用激光扫描共聚焦显微镜进行观察采图。1.2.7细胞凋亡接种 PDLSCs 于 6 孔板中,密度为 1105个/孔,待细胞生长融合至 30%50%时按分组进行转染。48 h 后,无 EDTA 胰
20、酶消化,PBS 洗涤细胞 2 次,每管依次加入 500 LBinding Buffer、5 L Annexin V-FITC、5 LPropidium Iodide 重悬细胞,混匀,室温避光孵育15 min,1 h 内于流式细胞仪下进行检测。1.2.8let-7a-5p 靶基因预测及功能分析通过TargetScan、miRDB、miRTarbase 3 个网站搜索let-7a-5p 的预测靶基因,取三者交集的靶基因进行基因本体(gene ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and geno-mes,KEGG)生物通路富
21、集分析,得到 let-7a-5p靶基因的相关细胞功能和信号通路,使用 R lan-guage package gplots 绘制GO 和KEGG 富集气泡图。1.3统计学处理实验数据采用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析及作图。选用MeanSD对数据进行描述,采用独立样本t检验进行单一变量 2 组资料间比较,采用单因素方差分析进行多组资料间比较,单 因 素 方 差 分 析 有 差 异 后 选 用 tukey smutiple comparisons test 进行两两比较。以P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1let-7a-5p 转染效率测定将 let-7a-5
22、p mimics、mimics nc、let-7a-5pinhibitor、inhibitor nc 转染至 PDLSCs 24 h 后,激光共聚焦显微镜下观察到大量绿色荧光颗粒分布于 PDLSCs 胞质中,见图 1A。RT-qPCR 定量分析转染效率结果显示,转染 48 h 后,let-7a-5pmimics 组的表达量为 mimics nc 组的 20.62 倍(P 0.01)。let-7a-5p inhibitor 组的表达量为 inhibitor30AB*#25201510210100 m100 mlet-7a-5p mimicslet-7a-5p mimics nclet-7a-5p
23、 inhibitorlet-7a-5p inhibitor nc0Relative miRNA expressionRelative miRNA expression0.51.01.5100 m100 m图1let-7a-5p 转染效率测定Fig.1Transfectionefficiencyoflet-7a-5pA:荧光验证 let-7a-5p 转染进入 PDLSCs;B:RT-qPCR 测定 let-7a-5p 转染效率。n=3,*P 0.01,#P 0.0001。第 10 期张晔琳,等hsa-let-7a-5p 调控牙周膜干细胞增殖及凋亡49nc 组的 0.23 倍(P 0.0001),
24、见图 1B。提示 let-7a-5p 成功且有效转染至 PDLSCs。2.2let-7a-5p 抑制牙周膜干细胞增殖将let-7a-5pmimics 及inhibitor 转染进PDLSCs后,通过 CCK8、EdU、细胞周期实验探究 let-7a-5p 对 PDLSCs 增殖能力的影响。CCK-8 实验结果显示,第 37 天,let-7a-5p mimics 组的增殖能力明显低于 mimics nc 组(第 3 天P 0.001,第47 天P 0.0001),见图 2A;而在第 7 天时,let-7a-5p inhibitor 组细胞增殖水平高于 inhibitornc 组(P 0.05),
25、见图 2B。EdU 实验结果显示,转染 48 h 后,mimics 组细胞增殖比例低于 mimicsnc 组(P 0.05),见图 2C;inhibitor 组细胞增殖比例高于 inhibitor nc 组(P 0.01),见图 2D。细胞3ACEFD*1.00.80.60.40.20Relative ratio of edu positive cellscontrolDAPIEdUMergeDAPIEdUMergemimicsmimics nccontrolinhibitorinhibitor nccontrolmimicsmimics nc*1.00.80.60.40.20150G2/MS
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