HPLC法同时测定茵栀解毒颗粒中3种有效成分的研究.pdf
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1、中图分类号 S859.79收稿日期 2 0 2 3-0 3-2 0【文献标识码 A文章编号 10 0 21280(2 0 2 3)0 9-0 0 40-0 7.-.doi:10.11751/IS2023.10.06Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第5 7 卷第10 期40.HPLC法同时测定茵解毒颗粒中3种有效成分的研究钟寒辉1,王彬?,陈晓林,余功富,林仙军1*(1.绿城农科检测技术有限公司,杭州310 0 5 1;2.浙江省动物疫病预防控制中心,杭州31110 1;台州市路桥区横街动物卫生所,浙江台州318 0 2 0
2、)【摘要为了建立同时测定中兽药菌解毒颗粒中绿原酸、子苷和黄苓苷的方法,研究采用高效液相色谱法,选用Cis色谱柱(2 5 0 mm4.6mm,5m),乙睛和0.0 5%磷酸溶液为流动相,流速1.0mL/min,进样量10 L,柱温为30,检测波长为2 30 nm。结果表明,子苷在3.110 15 5.5g/mL、黄芩苷在1.8 9 7 9 4.8 6 g/mL、绿原酸在2.47 8 12 3.9 g/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数均大于0.9 9 9,平均加样回收率分别为9 7.1%、9 6.2%和9 5.3%。该试验操作简便、快捷、定性、定量准确,能满足中兽药菌解毒颗粒中3种有效成分同时
3、检测的需要。关键词茵解毒颗粒;绿原酸;子苷;黄芩苷;高效液相色谱法Research on the Simultaneous Determination of Three Active Ingredients inGardenia Jasminoides Granules by HPLCZHONG Han-hui,WANC Bin?,CHEN Xiao-lin?,YU Gong-fu,LIN Xian-jun(1.Greentown Agricultural Testing Technology Co.,Ltd,Hangzhou 310051,China;2.Zhejiang Province
4、Supervisory Institute of Veterinary Drug and Feed,Hangzhou 311101,China;3.Hengjie Animal Health Supervision Institute Luqiao District Taizhou,Taizhou,Zhejiang 318020,China)Corresponding author:LIN Xian-jun,E-mail:xj1000 Abstract:In order to establish a method for the simultaneous determination of ch
5、lorogenic acid,gardeniaglucoside and baicalin in the Chinese veterinary medicine gardenia antidotes,a C18 column(250 mm 4.6 mm,5 m)with acetonitrile and 0.05%phosphoric acid as the mobile phases was used,the flow rate was 1.0 mL/min,the injection volume was 10 L,the column temperature was 30 a n d t
6、 h e d e t e c t i o n w a v e l e n g t h w a s 2 30nm.The linearity of the method was good in the range of 3.110 g/mL to 155.5 g/mL for gardenia glucoside,1.897 g/mL to 94.86 g/mL for baicalin and 2.478 g/mL to 123.9 g/mL for chlorogenic acid,with thecorrelation coefficients greater than 0.999.The
7、 average recoveries were 97.1%,96.2%and 95.3%,respectively.The test is simple,rapid,qualitative and quantitative,and can meet the needs of the simultaneousdetermination of the three active ingredients in the Chinese veterinary medicine gardenia antidote granules.作者简介:钟寒辉,工程师,从事食品、农产品和药品质量安全检测技术研究和管理
8、工作。通讯作者:林仙军。E-mail:Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第5 7 卷第10 期41Key words:yinzhi jiedu granule;chlorogenic acid;gardenia glycosides;baicalin;high performance liquid chro-matography中兽药茵解毒颗粒由5 味药材(茵陈、子、黄芩、虎杖和钩藤)通过一定的生产工艺制得 1-2 。具有清热解毒、疏肝解痉功效 3,兽医临床上用于维鸭病毒性肝炎的治疗 4-5 。兽药质量标准(2 0 17 年
9、版)中药卷收载了该标准 1,标准采用4个薄层色谱系统,分别鉴别子苷、黄芩苷、茵陈对照药材和虎杖对照药材,操作繁琐并且需要用到三氯甲烷、丙酮等多种管制试剂和一般有机试剂,试剂使用量也较大,对操作人员不友好。在含量测定方面,标准仅测定来自处方中茵陈的有效成分绿原酸的含量,评价药物质量方面不够全面。高效液相色谱法作为一种较成熟的分离技术 6 ,具有分离速度快、效率高、灵敏度高 7-8 、定性定量准确等优势 9-10 ,在兽药检验和质量监控中发挥越来越大的作用 11-12 。本试验采用高效液相色谱法对中兽药茵解毒颗粒中子苷、黄芩苷和绿原酸同时检测的方法进行了研究,建立方法的基础上开展了实际样品检测1材
10、料与方法1.1仪器高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司,型号12 6 0,配G4212A检测器);色谱柱(AgilentEclipse XDB-C18,250 mm 4.6 mm,5 m);电子天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司,型号AG-285);超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司KQ-500E型)。1.2主要试剂黄芩苷对照品(中国兽医药品监察所生产,批号为Z0271705,含量为9 6.8%);子苷对照品(中国食品药品检定研究院生产,批号为110749-201115,含量为9 9.7%);绿原酸对照品(中国兽医药品监察所生产,批号为Z0261702,含量为9 8.3%)。茵解毒颗粒(浙江企
11、业生产,批号为2 0 2 10 8 2 2、2 0 2 10 8 2 3和2 0 2 10 8 2 4等3批次)。1.3对照品贮备溶液取黄芩苷9.8 0 mg、绿原酸12.60mg和子苷15.6 0 mg,置10 0 mL量瓶中,加甲醇适量,震摇使溶解并定容。1.4供试品溶液称取茵解毒颗粒约1g,精密称定,置2 5 mL量瓶中,加人5 0%甲醇溶液约15mL,超声约2 0 min,用5 0%甲醇溶液定容。1.5色谱条件采用Agilent EclipseXDBC 18色谱柱(2 5 0 mm4.6mm,5m),流动相:0.0 5%磷酸溶液(A)和乙腈(B),梯度洗脱程序见表1;进样量10 L,柱
12、温30,流速为1.0 mL/min,用二极管阵列检测器进行扫描,扫描范围为2 10 nm400nm,记录2 30 nm波长处的色谱图。表1流动相梯度洗脱程序Tab 1Mobile phase gradient elution procedure时间(min)流动相A(%)流动相B(%)流速(mL/min)0.090101.08.090101.025.040601.035.040601.035.190101.040.090101.01.6方法学考察1.6.1线性范围取对照品贮备溶液用5 0%甲醇溶液分别稀释2 倍、5 倍、10 倍、2 0 倍和5 0 倍,作为线性实验溶液,取10 L进样,记录色
13、谱图和峰面积,以峰面积对浓度作图,绘制标准曲线。1.6.2精密度和稳定性试验按照建立的方法测定同一份样品6 次(批号为2 0 2 10 8 2 2),计算批内相对标准偏差,作为精密度试验;取精密度试验的样品溶液于间隔2 h、2 h、2 h、6 h 和12 h测定其含量,每次测定3次,取平均值,计算批内相对标准偏差,作为溶液稳定性试验1.6.3方法专属性取茵解毒颗粒样品3份,每份各1g,置于2 5 mL量瓶中,分别加1mol/L盐酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液和5%过氧化氢溶液,各1mL,摇匀,放置1h6,进行酸、碱和氧化破坏,加人5 0%甲醇溶液15 mL,超声2 0 min,5 0%甲醇溶
14、液定容,依法测定。Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2023年10 月第5 7 卷第10 期421.6.4加样回收率试验根据前期试验分析,3种药物的含量均约为1mg/g。因此,加样回收率的添加浓度定为1mg/g。在准确测定本底的情况下(测定6 次,取平均值),开展加样回收率试验。取3种对照品加甲醇配制成每毫升各约含1mg的溶液。另取样品6 份,各1g,精密称定,置2 5 mL量瓶中,分别加人相应对照品溶液各1.0 0 mL,按照建立的方法检测,结果减去相应本底,计算平均回收率和批内相对标准偏差。1.6.5实际样品的测定取3批次供试品,每批次各3个平
15、行,取每份样品各1g,按照1.4项配制供试品溶液,依法检测,计算平均含量。1.7提取溶剂的选择本试验设计时考虑到提取目标药物的性质,选择水、甲醇和5 0%甲醇超声2 0min以及水、甲醇和5 0%甲醇水浴回流2 0 min等方式提取药物中有效成分,另外参考文献 5 采用热水加甲醇提取2 0 min。2结果与分析2.1系统适用性试验在1.5 色谱条件下,对照品溶液和实际样品图谱中绿原酸、子苷和黄芩苷峰型对称,对称因子均在0.9 5 至1.0 5 之间,3种药物和其边上的峰,两者之间的分离度均大于1.5,理论板数以3种药物计均大于30 0 0,系统适用性试验各项指标符合要求,典型色谱图和光谱图见图
16、1图8。mAU400300SESST8892001000102030min保留时间/min注:出峰顺序为绿原酸、子苷和黄芩苷Note:The order of peaks is chlorogenic acid,gardenia glucoside and baicalin图1绿原酸、子苷和黄芩苷对照品溶液色谱图Fig 1Chromatogram of chlorogenic acid,gardeniaglucoside and baicalin control solutionmAU:200于92115010050寸V0220240260280300320340360380nm波长/nm图2
17、绿原酸对照品溶液光谱图Fig2Spectrum of chlorogenic acid control solutionmAUTTT16014012010080860V40209SsC8SE8896VV0220240 260280 300320 340360380nm波长/nm图3子苷对照品溶液光谱图Fig 3Spectrum of Gardenia jasminoides control solutionmAUTT7009LLZ?TTT600500916400898300200V1000220240260280300320 340360380nm波长/nm注:出峰顺序为绿原酸、子苷和黄芩苷N
18、ote:The order of peaks is chlorogenic acid,gardenia glucoside and baicalin图4黄苓苷对照品溶液光谱图Fig 4Spectrum of baicalin control solutionmAU200-150-100-1962150-0102030min保留时间/min图5茵解毒颗粒色谱图Fig5Chromatogram of Gardenia jasminoidesChinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第5 7 卷第10 期43mAU112010080604
19、09LLZ80620VVVVV02402602803003203403601220380nm波长/nm图6茵解毒颗粒中子苷光谱图Fig 6Spectrum of gardenia glycosides ingardenia antidote granulesMAUE3309LLZ?300250-916?200-150号V100-50-0TTT220240260280300320340360380nm波长/nm图7茵解毒颗粒中黄芩苷光谱图Fig 7Spectrum of baicalin in Yinjian Jiexing granules2.2标准曲线的绘制根据1.2、1.3和1.6.1数据
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