miR-378通过抑制小鼠肝炎症反应改善非酒精性脂肪性肝炎的损伤.pdf
《miR-378通过抑制小鼠肝炎症反应改善非酒精性脂肪性肝炎的损伤.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《miR-378通过抑制小鼠肝炎症反应改善非酒精性脂肪性肝炎的损伤.pdf(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、 385 CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol.46 No.5 2023 解剖学杂志 2023 年第 46 卷第 5 期miR-378通过抑制小鼠肝炎症反应改善非酒精性脂肪性肝炎的损伤*佘明豪1 杨文辉1 刘寒松1 余 洋1 张 磊2(郑州大学附属郑州中心医院,1 普通外科,2 消化内科,郑州 450007)摘要 目的:探讨miR-378对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发生及发展的作用及其机制。方法:将C57BL/6小鼠随机分为对照(正常饮食)组、NASH模型(高脂饮食)组、miR-378抑制剂(高脂饮食+antagomir-378)组、阴性抑制剂(高脂饮食+antag
2、omir阴性对照)组。观察小鼠肝系数和组织病理改变;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证NASH小鼠及各处理组肝组织的miR-378表达。应用自动化学分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平;qRT-PCR检测肝组织肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、转化生长因子(TGF-)和胶原蛋白12(Col12)的mRNA表达;免疫荧光检测TGF-和Col12蛋白表达。结果:与对照组比较,NASH模型组和阴性抑制剂组的肝系数显著升高;与NASH模型组比较,miR-378抑制剂组
3、肝系数显著下降。NASH模型组肝小叶结构不清,出现明显的肝细胞坏死、脂肪及炎症细胞浸润;miR-378抑制剂组肝小叶结构正常,肝细胞排列整齐,脂肪浸润减轻。NASH模型组和阴性抑制剂组miR-378表达较对照组显著升高;NASH模型组和阴性抑制剂组血清ALT和AST含量较对照组显著升高,而miR-378抑制剂组较NASH模型组含量显著下降;NASH模型组和阴性抑制剂组TNF-、IL-6 表达量较对照组明显升高,而IL-4明显下降,MCP-1差异无统计学意义;而miR-378抑制剂组TNF-、IL-6表达量较NASH模型组明显下降,IL-4明显上升;NASH模型组和阴性抑制剂组TGF-和Col1
4、2表达量较对照组明显升高;而与NASH模型组比较,miR-378抑制剂组TGF-和Col12表达量明显下降。结论:miR-378可能是NASH的危险因素,抑制miR-378的表达有利于缩短NASH病程,为NASH治疗提供了新的潜在治疗靶点。关键词 非酒精性脂肪性肝炎;肝;微小RNA-378;炎症因子;小鼠miR-378 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis injury by inhibiting hepatic inflammatory response in mice*She Minghao1,Yang Wenhui1,Liu Hansong1,
5、Yu Yang1,Zhang Lei2(1.Department of General Surgery,2.Department of Gastroenterology,Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Zhengzhou 450007,China)Abstract Objective:To study the role and mechanism of miR-378 in the occurrence and development of non-alcoholic steatohepatitis(N
6、ASH)animal model.Methods:C57BL/6 mice were randomly divided into control(normal diet)group,NASH model(high fat diet)group,miR-378 inhibitor group(high fat diet+antagomir-378)group,negative inhibitor(high-fat diet+antagomir negative control)group.Liver coefficient and histopathological changes was ob
7、served in mice.The real-time quantitative PCR(qRT-PCR)was used to verify the expression of miR-378 in liver tissues of mice with NASH disease.The levels of serum alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)were measured by Olympus automatic chemical analyzer.The qRT-PCR was used
8、to detect the expression levels of tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin 4(IL-4),interleukin 6(IL-6),monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)and transforming growth factor-(TGF-)and collagen type l 2(Col12)in liver tissues.Results:Compared with the control group,the liver coefficients of NASH mo
9、del group and negative inhibitor group were significantly increased.Compared with the NASH model group,the liver coefficient of miR-378 inhibitor group was decreased.The structure of hepatic lobule in the NASH model group was unclear,and there were obvious hepatocyte necrosis,hepatic cord disorder a
10、nd inflammatory cell infiltration.Then in the miR-378 inhibitor group,the structure of the hepatic lobule was normal under light microscope,and the hepatocytes were neatly arranged,*河南省高等学校重点科研项目计划(20A320052)第 1 作者 E-mail: 通信作者,E-mail:收稿日期:2022-08-31;修回日期:2023-07-16doi:10.3969/j.issn.1001-1633.2023.
11、05.004论 著 386 and the fat infitration was allevuated.The expression of miR-378 in the NASH model group and in the negative inhibitor group was significantly higher than that in the control group.Serum ALT and AST levels were significantly higher in NASH model group and in the negative inhibitor grou
12、p than those in the control group.Compared with the NASH model group,miR-378 inhibitor group showed a significant decrease in the serum ALT and AST levels.The expression of TNF-and IL-6 in the NASH model group and in the negative inhibitor group were significantly higher than those in the control gr
13、oup,while IL-4 was significantly decreased,and the difference in MCP-1 was not statistically significant.Compared with the NASH model group and in the negative inhibitor group,the expression of TNF-and IL-6 in the miR-378 inhibitor group was decreased significantly and IL-4 was increased significant
14、ly.The expression of TGF-and Col12 was significantly higher in the NASH model group and the negative inhibitor group than those in the control group.In comparison to the NASH model group,the miR-378 inhibitor group showed a significant decrease in the expression levels of TGF-and Col12.Conclusion:Mi
15、R-378 may be a risk factor for NASH.Therefore,inhibiting the expression of miR-378 is beneficial for shortening the course and treatment of NASH disease,providing a new potential therapeutic target for NASH.Key words non-alcoholic steatohepatitis;liver;microRNA-378;inflammatory factors;mouse非酒精性脂肪性肝
16、炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)特征为肝脂肪变性和炎症1。西方国家NASH的发病率为20%45%2-3。据报道,慢性肝脏炎症被认为是导致NASH发生发展的主要因素4。微小RNA(microRNA,miRNA)是具有1825个核苷酸的RNA,为非编码RNA的一种。有研究显示,肝病患者与正常人群中miRNA表达谱存在显著差异5。越来越多的证据表明miRNA在多种生物学过程和许多疾病的发病机制中发挥重要作用,如miR-33a、miR-34a和miR-24已显示出作为NASH发展的因素,有可能成为NASH进展中肝炎的标志物6。目前,有研究证实miR-378在引
17、发肝炎和促进肝纤维化中起到重要作用,其可通过核因子B(nuclear factor B,NFB)-肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF)信号通路促进肝组织发生炎症甚至纤维化7。然而其在NASH中的作用及其机制尚不明确。因此,本研究通过建立NASH小鼠模型组及miR-378干预组,探讨miR-378在NASH发生及发展中的作用及其机制,为NASH的靶向治疗提供理论依据。1 材料和方法1.1 实验动物与分组SPF级健康C57BL/6雄鼠20只,雌鼠20只,8周龄,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号SCXK(京)2012-0001、SYXK(辽)-201
18、0-0002。动物饲养在符合GB149252010实验动物环境及设施有关要求的屏障环境中,12 h/12 h昼夜光照循环,动物室温度 252,相对湿度50%2%,自由进食、饮水。适应性饲养1周后,将40只C57BL/6小鼠按照体质量随机分为对照组(正常饮食组)、NASH模型组(高脂饮食组)、miR-378抑制剂组(高脂饮食+antagomir-378)、阴性抑制剂组(高脂饮食+antagomir阴性对照)。NASH模型组通过高脂饮食处理8周,其中高脂饮食包含15%的可可脂、1.25%的胆固醇但不含胆酸盐;miR-378抑制剂组及阴性抑制剂组均每周以2 mg/kg的剂量进行尾静脉注射miR-37
19、8抑制剂antagomir和antagomir阴性对照溶液,共6周。麻醉处死各组小鼠,取血清和肝组织,-80保存。1.2 主要试剂cDNA逆 转 录 试 剂 盒、SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒(TaKaRa,中国);TRIzol(BBI,中国);抑制剂miR-378 antagomir、阴性对照抑制剂(吉玛吉因,中国);高脂饲料(维通利华,中国)。1.3 小鼠肝系数测定乙醚麻醉小鼠,腹主动脉采血后处死,摘取肝,剥去周围结缔组织及脂肪组织,对肝进行称重,计算肝系数。肝系数(%)=肝湿重(g)/体质量(g)100%1.4 小鼠肝代谢分析根据制造商的说明,使用Olympus AU5
20、400自动化学分析仪检测各组小鼠血清肝炎症损伤指标丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平。1.5 小鼠肝组织的病理学检测每组随机选取3只小鼠的肝,置于4%多聚甲醛固定液中固定,1周后石蜡包埋切片(3 m),分别采用H-E、油红O、Masson染色试剂盒对各组肝组织进行染色,光学显微镜下观察组织形态。1.6 免疫荧光检测肝纤维化蛋白的表达挑选所需组织切片,常规脱蜡,置于封闭液 387(0.01 mol/L PBS,0.3%Triton X-100,3%山羊血清)1 h,一
21、抗转化生长因子-(transforming growth factor-,TGF-,1500 稀释,Abcam 公司,美国)和胶原蛋白12(collagen type l 2,Col12,11 000 稀释,Abcam 公司,美国),4孵育过夜。加入二抗(11 000,Abcam公司,美国),室温、避光、摇床孵育2 h。防淬灭封片剂封片,避光风干,共聚焦显微镜观察、拍片记录。1.7 肝 组 织TNF-、白 细 胞 介 素4(interleukin 4,IL-4)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant pro
22、tein-1,MCP-1)、TGF-和Col12基因表达的检测采用总RNA 提取分离试剂盒(TIANGEN,中国)对肝样本进行总RNA的提取,然后将提取的miRNA通过 miRcute miRNA第一链合成试剂盒(TIANGEN,中国)进行cDNA的合成,按逆转录试剂盒反应说明书操作。通过miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN,中国)对miR-378表达量进行检测,内参基因为U6;用SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒对肝组织TNF-、IL-4、IL-6、MCP-1、TGF-和Col12 mRNA表 达 量 进行检测,内参基因为GAPDH,依据 2-ct计算各
23、miRNA及mRNA的相对表达量。引物序列见表1。表 1 荧光定量 PCR 引物序列基因引物序列 5-3TNF-上游引物:GTGGAACTGGCAGAAGAG下游引物:AATGAGAAGAGGCTGAGACIL-4上游引物:CGGAGATGGATGTGCCAAAC下游引物:GCACCTTGGAAGCCCTACAGIL-6上游引物:CCGGAGAGGAGACTTCACAG下游引物:TCCACGATTTCCCAGAGAACMCP-1上游引物:ATTGGGATCATCTTGCTGGT下游引物:CCTGCTGTTCACAGTTGCCTGF-上游引物:AACAATTCCTGGCGTTACCTT下游引物:
24、CTGCCGTACAAC TCCAGTGACol12上游引物:CAGAACATCACCTACCACTGCAA下游引物:TTCAACATCGTTGGAACCCTGGAPDH上游引物:TGGGTTTCCCGTTGATGA下游引物:AGGGCTGCCTTCTCTTGTmiR-378上游引物:CTCCTGACTCCAGGTCCTGT下游引物:TGGTGTCGTGGAGTCG U6上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA下游引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT1.8 统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布且方差齐性检验合格后,采用单因素方差分析(one-way A
25、NOVA),与对照组比较采用 Dunnett 法分析;不符合则用非参数检验进行分析。检验水准=0.05。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 各组小鼠肝系数及肝病理学变化与 对 照 组(0.05180.0033)g/100 g比 较,NASH模 型 组(0.06420.0012)g/100 g和 阴 性抑制剂组(0.05940.0049)g/100 g的肝系数显著升高;与NASH模型组比较,miR-378抑制剂组(0.05320.0024)g/100 g肝系数下降,差异均有统计学意义(P0.05)。对照组小鼠肝呈鲜红色,表面光滑且无纤维化及脂肪浸润;NASH模型组肝小叶结构不清,出现明
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- miR 378 通过 抑制 小鼠 肝炎 反应 改善 酒精性 脂肪性 损伤
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。