CD4 Foxp3 调节性T细胞对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响.pdf
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1、论著CD4+Foxp3+调节性 T细胞对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响中国医药导报2 0 2 3年9 月第2 0 卷第2 7 期刘翠翠吴亚星张淑婷李向鑫张静一徐州医科大学徐州临床学院,江苏徐州2 2 10 0 0摘要】目的研究CD4+Foxp3+调节性T细胞对骨髓间充质干细胞(BMMSC)成骨分化能力的影响。方法实验分为三组,对照组为CD4+初始T细胞和BMMSC;实验组为调节性T细胞与BMMSC;抑制组为调节性T细胞与BMMSC并加人GW4869(外泌体抑制剂)。三组均进行矿化诱导。在0、7 d时碱性磷酸酶(ALP)染色和活性检测ALP表达及活性,在0、2 1d时茜素红染色和钙含量分析检
2、测矿化结节形成及钙含量,在7 d时PCR检测骨向分化基因ALP、O C N和Runx2mRNA水平。结果实验组ALP染色面积及ALP活性高于对照组(P0.01),茜素红染色矿化结节形成及钙含量高于对照组(P0.01);ALP、O CN和Runx2mRNA水平高于对照组(P0.01)。抑制组ALP染色面积及ALP活性低于实验组(P0.001),茜素红染色矿化结节形成及钙含量低于实验组(P0.01),ALP、O C N和Runx2mRNA水平低于实验组(P0.01)。结论调节性T细胞能够促进BMMSC成骨分化,其外泌体可能参与了这一过程。关键词 调节性T细胞;骨髓间充质干细胞;细胞分化;成骨分化中
3、图分类号 R781.42D0I:10.20047/j.issn1673-7210.2023.27.03Effect of CD4+Foxp3+regulatory T cell on the osteogenic differentiation ofbone marrow mesenchymal stem cellsLIU Cuicui WU Yaxing ZHANG Shuting LI Xiangxin ZHANG Jing-Affiliated Xuzhou Clinical College,Xuzhou Medical University,Jiangsu Province,Xuzho
4、u 221000,ChinaAbstract Objective To investigate the effect of CD4*Foxp3*regulatory T cell on the osteogenic differentiation of bonemarrow mesenchymal stem cell(BMMSC).Methods The experiment was divided into three groups,the control group con-sisted of CD4+T cells and BMMSC;the experimental group con
5、sisted ofregulatory T cells and BMMSC;the inhibitory groupconsisted of regulatory T cells and BMMSC and added GW4869(exosome inhibitor).Mineralization induction was performedin all three groups.ALP expression and activity were detected by alkaline phosphatase(ALP)staining and activity at day Oand 7,
6、mineralization nodules formation and calcium content were detected by alizarin red staining and calcium contentanalysis at day 0 and 21,levels of bone differentiation genes ALP,OCN,and Runx2 mRNA were detected by PCR at day 7.Results the ALP staining area and ALP activity in the experimental group w
7、ere higher than those in the control group(P0.01).The formation and calcium content of mineralized nodules stained with alizarin red were higher than those in the con-trol group(P0.01),and the expression levels of ALP,OCN,and Runx2 mRNA were higher than those in the control group(P0.01).The ALP stai
8、ning area and ALP activity in the inhibitory group were lower than those in the experimental group(P0.01),the formation and calcium content of mineralized nodules stained with alizarin red were lower than those in theexperimental group(P0.01),and the expression levels of ALP,OCN,and Runx2 mRNA were
9、lower than those in the ex-perimental group(P0.01).Conclusion Tregs could promote the osteogenic differentiation of BMMSC,and Tregs exosomesmay participate in this process.Key words Regulatory T cell;Bone marrow mesenchymal stem cell;Cell differentiation;Osteogenic dfferentiation牙周炎引起的牙槽骨吸收是造成牙齿松动甚至
10、脱落的主要病因叫,临床上通过常规的牙周治疗较难基金项目 国家自然科学基金青年科学基金项目(317 0 0 8 14);江苏省徐州市科技项目(KC18032)。作者简介 刘翠翠(1995.10-),女,徐州医科大学口腔医学院2020级口腔正畸学专业在读硕士研究生;研究方向:口腔正畸及干细胞基础研究。一通讯作者16CHINA MEDICAL HERALD Vol.20 No.27 September 2023文献标识码 A文章编号 16 7 3-7 2 10(2 0 2 3)0 9(c)-0016-04完全恢复牙周组织的结构和功能,因此如何促进牙槽骨的修复及再生是治疗牙周炎的重要环节。骨髓间充质干
11、细胞(bone marrowmesenchymal stemcell,BMMSC)近年来在修复牙周炎引起的骨组织缺损方面得到了广泛应用2-5。研究证实,BMMSC发挥抗感染功能的一个重要机制是其能分泌可溶性因子,使BMMSC与免疫细胞相互作用,诱导调节性T细胞形成6-7,调节性T细胞通过调节损伤局部微环境、减少中国医药导报2 0 2 3年9 月第2 0 卷第2 7 期论著炎症因子分泌发挥其抗感染和免疫抑制作用18-9。近年研究显示,调节性T细胞外泌体能够发挥与其同样的作用,是调节性T细胞发挥生物功能不可或缺的组成部分0。前期研究证实炎性环境下BMMSC上清液中高表达的转化生长因子(transf
12、orminggrowthfactor,TGF)-1促进了BMMSC内骨向分化标志物的表达。然而调节性T细胞是否参与了BMMSC的骨向分化及其是否通过外泌体来调控BMMSC的骨向分化目前仍不清楚。因此,本研究通过调节性T细胞与BMMSC共培养来明确其在BMMSC骨向分化中的作用,同时对调节性T细胞外泌体在骨向分化中的作用进行初步探讨。1材料与方法1.1 主要材料BMMSC(ScienCell,USA);CD4+T细胞分离试剂盒(M i l t e n y i Bi o t e c,G ER);碱性磷酸酶(alkaline phos-phatase,ALP)活性试剂盒;茜素红、ALP染色试剂盒(S
13、igma-Aldrich);钙含量试剂盒(Sigma-Aldrich)。1.2实验方法1.2.1分离和诱导CD4+初始T细胞分化为调节性T细胞小鼠脾细胞用CD4T细胞分离试剂盒分离出幼稚CD4+初始T细胞(CD4+naiveTcells,ThO)。采用抗CD3、抗CD28、T G F-和白细胞介素(interleukin,IL)-2激活分离的ThO。用FITC偶联抗CD45RA和APC偶联抗CD4抗体染色及PE标记的抗Foxp3抗体染色,流式细胞术鉴定。本研究经徐州医科大学附属徐州市中心医院伦理委员会批准(XZXY-LJ-20170217-003)。1.2.2分组方法浆细胞分为对照组、实验组、
14、抑制组。对照组:ThO与BMMSC共培养并矿化诱导;实验组:将ThO诱导为调节性T细胞后,与BMMSC共培养并矿化诱导;抑制组:在实验组基础上加人10 mol/LGW4869(外泌体抑制剂)并矿化诱导。三组分别于0、7d进行ALP染色,7 d进行ALP活性检测,0 d和2 1d进行茜素红染色,2 1d进行钙含量分析及7 d进行骨向分化基因的检测,所有实验均重复3次。1.2.3ALP染色及活性检测在0、7 d进行ALP染色,染色面积应用ImageJ软件定量分析;7 d时用ALP活性试剂盒检测ALP活性,酶标仪在52 0 nm波长测定OD值。1.2.4茜素红染色及钙含量分析第0、2 1天使用茜素红
15、染色,镜下观察染色及矿化结节形成情况;第2 1天使用钙含量试剂盒检测56 2 nm波长处OD值,确定钙浓度。1.2.5骨向分化基因的检测在7 d时提取总RNA,逆转录合成cDNA。PCR反应体系总体积2 0 l,加人SYNERGreenqPCRMasterMix10l,正反向引物各0.4l,相应cDNA2l,Nuclease-Freewater补足至2 0 l。按95预变性10 s;955s,6 0 34s,共40 个循环,以GAPDH为内参基因,检测ALP、O C N、Ru n x 2 成骨相关基因的表达。引物序列见表1。表1实时定量PCR引物序列基因引物5-3”Runx2正向引物:CCCA
16、GCCACCTTTACCTACA反向引物:TATGGAGTGCTGCTGGTCTGALP正向引物:AACAGACCCTCCCCACGAGT反向引物:GTGCCGATGGCCAGTACTAAOCN正向引物:AGGGCAATAAGGTAGTGAA反向引物:CGTAGATGCGTCTGTAGGCGAPDH正向引物:TGTGATGCGTGTGAACCACG反向引物:CAGTGAGCTTCCCGTTCACC1.3统计学方法采用GraphPadPrism9.3.1软件进行数据分析。计量资料采用均值标准差(x土s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。以P 8 5%,根据免疫
17、表型确定为调节性T细胞。见图1。0.84%0611-2.2ALP染色及活性检测实验组ALP染色较对照组染色深,染色面积较大(P0.05);抑制组ALP染色面积小于实验组(P0.01);实验组ALP活性高于对照组(P0.01),抑制组ALP活性低于实验组(P0.01)。见图2。2.3各组茜素红染色及钙含量分析实验组较对照组矿化结节形成多,染色明显,抑制组比实验组矿化结节形成明显减少。实验组内钙含量高于对照组,抑制组钙含量低于实验组(P0.01)。见图3。2.4各组骨向分化基因相对表达量比较实验组ALP、O C N、Ru n x 2 m RNA 相对表达比对照组(P0.01);抑制组ALP、O C
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