羊角天麻抑菌作用及其活性部位初步研究.pdf
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1、收稿日期2023-02-15修回日期2023-03-08第一作者简介苏包顺,农艺师,主要从事中药材种植及质量检测研究。*通信作者:刘志彤,高级农艺师,E-mail:。羊角天麻 Dobinea delavayi(Baill.)Baill.为漆树科 Anacardiaceae 九子母属 Dobinea 多年生亚灌木状草本植物,以“小九牯牛”之名首次记载于 滇南本草1,又名绿天麻、九子不离母、大九股牛等,我国主要分布在云南、四川、西藏等地,其根茎炮制后状如羊角,因此得名羊角天麻2。羊角天麻在民间用药历史悠久,具有通经活络、消炎止痛的功效,主要用于治疗腮腺炎、乳腺炎、痈疱、疮毒等3-5,此外还可用于治
2、疗肺痨咳嗽6,肺痨咳嗽的病因可能为感染痨虫7,即感染病菌。近年来,随着对羊角天麻研究的逐渐深入,其化学成分和药理作用取得了较大进展,研究人员已从羊角天麻中分离获得倍半萜类、黄酮类、二甲苯酮类、脂肪族类、甾体类等成分8。毒理研究9显示,小鼠急性毒性实验未测出半数致死量,说明羊角天麻具有较好的安全性,临床用药安全可靠。目前,对羊角天麻的研究主要是真伪鉴别10、生药学研究11、抗疟12、抗肿瘤13研究,有关抑菌活性的研究尚未有报道。基于此,本研究对羊角天麻的 7 个活性部位的抑菌活性进行了筛选,为羊角天麻的进一步开发利用提供参考。1材料与仪器1.1药材羊角天麻购自昆明市菊花园中药材市场,经重庆三峡学
3、院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为植物羊角天麻的干燥根茎。1.2菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methi-cillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌均购于北京莱耀生物科技有限公司。1.3仪器及试剂1.3.1实验仪器双人单面净化工作台(苏州净化设备厂);冷冻干燥机(宁波新芝冻干设备股份有限公司);生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)。1.3.2实验试剂盐酸万古霉素、氯霉素(华北制药 集 团 新 药 研 究 开 发 有 限 责 任 公 司,批 号:2021036、20200906);石油醚、氯仿(云南汕滇药业有限公司,批号:
4、20170612、20150604);乙酸乙酯(天津风船化学试剂科技有限公司,批号:090905);羊角天麻抑菌作用及其活性部位初步研究苏包顺1,刘志彤2*(1援大理市林韵生物科技开发有限责任公司,云南大理671099;2援巍山彝族回族自治县农业农村局园艺工作站,云南巍山672400)摘要目的:探讨羊角天麻的抑菌作用及其活性部位。方法:提取羊角天麻水部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、30%醇沉部位、60%醇沉部位、95%醇沉部位,采用琼脂平板二倍稀释法测定以上 7 个部位对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(酝砸杂粤)、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的最低抑菌浓度,并探讨温度、紫外线对羊角天麻不同活
5、性部位抑菌活性的影响。结果:羊角天麻水部位对 MRSA、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌有抑制作用,60%醇沉部位、95%醇沉部位对 MRSA、金黄色葡萄球菌有抑制作用,抑菌圈直径分别为(21.2依0.6)、(20.4依0.1)、(19.6依0.6)、(20.6依0.1)、(22.2依0.2)、(17.5依0.2)、(20.3依0.3)mm,石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位无抑菌活性。此外,羊角天麻水部位、60%醇沉部位、95%醇沉部位对高温和紫外线敏感。结论:羊角天麻具有确切的体外抑菌活性,水部位是抑制 MRSA、粪肠球菌的主要活性部位,60%乙醇沉部位是抑制金黄色葡萄球菌的主要活性部位,该研究
6、为羊角天麻的综合利用与开发提供了理论依据。关键词羊角天麻;提取;抑菌作用;活性部位;稳定性中图分类号R284文献标志码A文章编号2096-2266(2023)08-0039-05DOI10.3969/j.issn.2096-2266.2023.08.008大理大学学报JOURNAL OF DALI UNIVERSITY第8卷第8期2023年8月Vol.8No.8Aug.2023正丁醇(利安隆博华医药化学有限公司,批号:20131025);无水乙醇(广东光华化学厂有限公司,批号:20090916);二甲基亚砜(DMSO,北京索莱宝科技有限公司,批号:1121E0322);LB 培养基、BHI培养
7、基(广东环凯微生物科技有限公司,批号:1090641、1095901)。2方法2.1各活性部位提取方法2.1.1有机相部位提取方法称取 4 kg 干燥的羊角天麻根茎在 85 益下用中药真空提取浓缩机提取3 次,每次 2 h,合并浓缩液,过滤,得水提浓缩液。水提浓缩液用石油醚萃取,回收有机相,得石油醚层;剩余水相用乙酸乙酯萃取,得乙酸乙酯层;水相进一步用正丁醇萃取,得正丁醇层。2.1.2醇沉部位提取方法取“2.1.1”项中剩余的水层液,浓缩,用 30%乙醇沉淀,静置过夜,4 000 r/min 离心 10 min,沉淀留存,浓缩上清液;再用 60%乙醇沉淀,静置过夜,4 000 r/min 离心
8、 10 min,沉淀留存,浓缩上清液;再用 95%乙醇沉淀,静置过夜,4 000 r/min 离心 10 min,沉淀留存,剩余上清液备用。分别取上述所得的羊角天麻醇沉部位沉淀,加入蒸馏水溶解,加入 sevage 试剂(氯仿颐正丁醇=4颐1,V颐V),剧烈振荡 20 min,静置分层,去除白色中间层,反复加入 sevage 试剂进行提取,直至无法观察到白色的中间层。浓缩水层,冻干干燥得到羊角天麻 30%、60%、95%醇沉羊角天麻多糖。2.1.3水部位提取方法取“2.1.2”项中剩余的上清液,减压浓缩,冷冻干燥,得水部位。2.2体外抑菌活性试验采用牛津杯法进行体外抑菌活性试验,采用琼脂平板二倍
9、稀释法15进行最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,酝陨悦)测定,分别测定羊角天麻石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位、30%醇沉部位、60%醇沉部位、95%醇沉部位对 3 株病原菌的体外抑菌活性和 MIC。2.2.1含药平板制备将羊角天麻 7 个部位提取液(1 000 mg/mL)用无菌水进行倍比稀释,浓度分别为 1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8mg/mL,共 8 个浓度。将 1 mL 不同浓度的稀释液和14 mL 培养基分别加入一次性无菌培养皿中,充分混合,待培养基冷却凝固后备用。37
10、 益培养 24 h,观察试验菌的生长情况,每组重复 3 次。2.2.2菌液配制挑取 3 株菌株适量菌体至液体培养基试管,转至振荡培养箱中,37 益、150 r/min,培养 1 h 后调整细菌溶液浓度至 1.5伊108CFU/mL。2.2.3MIC 测定取 120 滋L 供试菌悬液到不同浓度梯度的含药板和阳性对照板,均匀涂布,使用DMSO 为阴性对照,盐酸万古霉素为 MRSA 的阳性对照,氯霉素为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的阳性对照。将平板置于 4 益冰箱中 4 h,再放入 37 益恒温培养箱中培养 824 h,并统计抑菌圈直径,每组重复 3 次。与阴性、阳性对照比较,培养皿中无细菌生长的最小质
11、量浓度是试验部位对细菌的 酝陨悦。2.2.4热处理对具有体外抑菌作用的活性部位提取液抑菌稳定性的影响将具有体外抑菌作用的活性部位提取液分别在 60、80、100、121 益下依次处理 30 min,未经处理的提取液用作对照,分别进行 3 组抑菌试验以确定抑菌圈的直径,计算平均值。2.2.5紫外线照射对具有体外抑菌作用的活性部位提取液抑菌稳定性的影响将具有体外抑菌作用的活性部位提取液分别在紫外灯下照射 10、20、30、40、50 min,未经处理的提取液用作对照,分别进行 3 组抑菌试验以确定抑菌圈的直径,计算平均值。2.3数据处理与分析采用 Microsoft Office 2010、Gra
12、phpad Prism 9.0 软件进行数据处理与分析,计数资料用(x依s)表示。3 结果3.1 羊角天麻不同活性部位的体外抑菌活性使用牛津杯法研究羊角天麻不同活性部位对 MRSA、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的体外抑菌作用,试验结果显示羊角天麻石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、30%醇沉部位、阅酝杂韵 对 3 种细菌均无抑制作用;盐酸万古霉素对 酝砸杂粤 的抑菌圈直径为(24.6依0.2)mm;氯霉素对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的抑菌圈直径分别为(23.6依0.3)、(27.3依0.5)mm;大理大学学报总第 92 期自然科学注:粤.羊角天麻水部位;月.羊角天麻 60%醇沉部位;悦.羊角天麻
13、95%醇沉部位。图 1热处理对羊角天麻不同活性部位抑菌活性的影响月粤悦3.3热处理对羊角天麻不同活性部位抑菌活性的影响对羊角天麻不同活性部位在不同温度下进行热处理,并进行抑菌试验,以确定其热稳定性,结果见图 1。从图 1 可以看出,随着热处理温度的升高,羊角天麻不同活性部位对 3 种试验菌的抑菌活性呈下降趋势。与对照相比,在 60 益和 80 益热处理后,羊角天麻的 3 个活性部位对 3 种试验菌的抑菌圈直径略有减小,抑菌活性略有下降,但仍保持明显的抑菌活性;经过 100 益处理后,抑菌活性均明显下降,其中水部位对粪肠球菌的抑菌圈直径减小60%醇沉部位对 MRSA、金黄色葡萄球菌有抑制作用,抑
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