一株产纤维素酶菌株的分离纯化及其产酶性质研究.pdf
《一株产纤维素酶菌株的分离纯化及其产酶性质研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一株产纤维素酶菌株的分离纯化及其产酶性质研究.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、研究报告D0I:10.13995/ki.11-1802/ts.033847引用格式:黄翠欣,张桂容,刘军,等.一株产纤维素酶菌株的分离纯化及其产酶性质研究 J.食品与发酵工业,2 0 2 3,49(17):37-43.HUANG Cuixin,ZHANG Guirong,LIU Jun,et al.Isolation and purification of a cellulose-producing strain and its en-zyme-producing propertiesJ.Food and Fermentation Industries,2023,49(17):37-43.一株
2、产纤维素酶菌株的分离纯化及其产酶性质研究黄翠欣,张桂容,刘军,舒林,曹荣”,温雪瓶,李丽1.4*1(四川轻化工大学生物工程学院,四川宜宾,6 440 0 0)2(四川思来生物科技有限公司,四川成都,6 10 0 0 0)3(四川太源井醋业有限公司,四川自贡,6 430 0 0)4(固态发酵资源利用四川省重点实验室,四川宜宾,6 440 0 0)摘要该研究以四川晒醋醋醋为研究对象,从醋醋中筛选出1株纤维素酶活力较高的霉菌,结合生理生化特性和ITS基因序列同源性分析对菌株进行鉴定,通过单因素试验、正交试验探究其产酶条件及酶学性质。结果显示,筛选出的霉菌为横梗霉菌(Lichtheimiaramosa
3、),在菌悬液浓度为3.510 CFU/mL、1%接种量、30 和180r/min恒温振荡培养2 4h的条件下提取粗酶液,并置于50 反应30 min;其内切葡聚糖酶活力在pH5.0时达到最大值为9 5.9 2 U/mL,-葡萄糖苷酶活力在pH6.0时达到最大值为47.57 U/mL。该研究揭示了横梗霉菌在醋发酵过程中产生了内切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶,且二者较好的pH值稳定性和热稳定性,研究结果为四川晒醋的生产提供了一定的参考价值。关键词四川晒醋;分离鉴定;横梗霉菌;内切葡聚糖酶;-葡萄糖苷酶四川晒醋是麸醋的一类,以麸皮和大米为主要原料,用药曲做糖化剂,采取糖化、酒化、醋化同池进行的生料开放式多
4、菌混合固态发酵工艺。经蒸煮、发酵、日晒(其醋醋和成品醋均经日光暴晒)、陈酿四大工艺流程,2 0 多道工序,使得四川晒醋色泽黑褐、无沉淀、香气芬芳,具有酸味醇厚、微甜爽口、回味悠长、久存不腐的特点1-2 。霉菌是食醋发酵过程中一类重要的微生物,包括毛霉、曲霉、青霉等,在发酵过程中不仅起着糖化、液化等作用,还与食醋风味、品质等紧密相关 3-4在食醋酿造过程中,通过添加纤维素酶生产菌种可以提升食醋风味 5-6 ,微生物所产生的纤维素酶系是一个多组分酶系,通常将纤维素酶分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶,可将纤维素水解成葡萄糖,用于生产乙醇、有机酸等化合物 7 。在这三类酶的协同作用下,纤维
5、素可降解为葡萄糖,内切葡聚糖酶作用于纤维素的非结晶区,将纤维素切割成聚合度不同的短链纤维素;外切葡聚糖酶从短链纤维素的非还原端开始水解-1,4糖苷键,释放纤维二糖;-葡萄糖苷酶通过将纤维素二糖转化为葡萄糖来完成纤维素水解的最后一步 8-9 本研究从四川晒醋醋酷中分离得到一株能够产纤维素酶的菌株,结合生理生化试验和分子生物学手第一作者:硕士研究生(李丽教授为通信作者,E-mail:l i _l i 8 2 10 0 8 16 3.c o m)基金项目:四川省科技厅重点研发项目(2 0 2 1YFN0095);固态发酵资源利用四川省重点实验室开放基金项目(2 0 2 1GTJC05)收稿日期:2
6、0 2 2-10-0 4,改回日期:2 0 2 2-11-0 5段鉴定为横梗霉菌(Lichtheimia ramosa),以内切葡聚糖、-葡萄糖苷酶活力为指标,通过单因素试验、正交试验确定该菌的产酶条件及酶学性质,以期为后期横梗霉菌与四川晒醋风味物质形成的相关性研究提供理论依据,并为四川晒醋的生产提供了一定的参考价值。1材料与方法1.1材料与设备醋酷,采集于四川某晒醋厂。主要试剂:羧甲基纤维素钠、Na,SO3、乙酸、乙酸钠、葡萄糖(分析纯),成都科隆化学品有限公司;牛肉膏、蛋白陈(生化级),成都奥博星生物技术有限公司;酵母膏(生化试剂),上海展云化工有限公司;刚果红,天津市大茂化学试剂厂;水杨
7、苷(分析纯),上海阿拉丁科技股份有限公司;琼脂(食品级),石狮市环球琼胶工业有限公司;马铃薯,市售。T-114电子天平,奥豪斯仪器有限公司;QYC-2102C型恒温培养摇床,上海福马实验设备有限公司;BSG-24水浴锅、THZ-98C恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;T6紫外-可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;YXQ-75SII高压蒸汽灭菌锅,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;BM1000显微镜,南京江南永新光学有限公司;AT-710型pH2023年第49 卷第17 期(总第48 5期)37食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES计,日本京都电子制造
8、有限公司;SW-CJ-1FD单人单面净化超净工作台,上海沪净医疗器械有限公司。1.2培养基基础培养基(g/L):(NH 4),SO 45,K H,PO 41,MgS047H,05,CaCl,2H,00.1,酵母膏0.2,NaCl0.1,碳源10(氮源5)。马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,PDA)培养基、羧甲基纤维素钠培养基参考文献10 11 配制;胰蛋白陈大豆肉汤(tryptose soyabroth,T SB)培养基、明胶培养基、淀粉水解培养基参考文献12 配制。1.3实验方法1.3.1茵菌株分离鉴定1.3.1.1产纤维素酶菌株的筛选取10 g醋酪投入盛有9 0 mL
9、无菌水的三角瓶中,充分振荡后梯度稀释至10-1 10-。取上述各梯度的稀释液10 0 L涂布于PDA平板上,30 倒置培养至长出单菌落。挑取单菌落点接于羧甲基纤维素钠培养基中,30 恒温培养48 h后,倒人1mg/mL刚果红溶液染色10 min,倒去刚果红溶液,向平板加人1mol/L的NaCl溶液浸泡15min脱色,观察菌落周围有无水解圈,并测量菌圈比,并且将产纤维素酶活力较强的菌株进行斜面保藏。1.3.1.2菌株形态观察载片培养 13 后进行光学显微镜观察。1.3.1.3菌株的生理生化特性观察根据伯杰系统细菌鉴定手册 14 和微生物分类学 15 对菌种进行碳氮源利用试验、温度耐受试验、盐耐受
10、试验、明胶液化试验、淀粉水解试验。1.3.1.4菌株分子鉴定采用DNA试剂盒对筛选到的菌株进行全基因组提取,以ITS1/ITS4进行PCR扩增,经纯化后送至上海派森诺生物科技有限公司测序。测序结果用NCBIBlast程序将拼接后的序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对,得到与待测物种序列相似性最大的物种信息,利用软件MEGA6构建系统发育树。1.3.2单因素试验1.3.2.1培养时间对横梗霉菌产酶能力影响将菌株接种于PDA斜面培养基,于30 培养48h后,用无菌水洗脱孢子,调节稀释倍数,用血球计数板计孢子数,使生物量为3.510 CFU/mL,再以5%(体积分数,下同)接种量接种于PDA
11、发酵培382023 Vol.49 No.17(Total 485)养基,分别测定培养12、2 4、36、48、6 0、7 2 h后的纤维素酶活力。1.3.2.2接种量对横梗霉菌产酶能力影响根据1.3.2.1节的测定结果,选择最优培养时间,在此培养时间条件下探索不同接种量(0.5%、1%、3%、5%、7%和9%)对产酶的影响。1.3.2.3反应温度对酶活力的影响在确定接种量、发酵时间后,取粗酶液,设置不同的反应温度(4、30、40、50.6 0),比较反应温度对纤维素酶活性的影响。1.3.2.4pH值对酶活力的影响在最适反应温度的基础上,设置不同酶反应体系pH值(3.0 10.0),测定不同pH
12、值条件对纤维素酶活性的影响。1.3.3正交设计试验在单因素试验基础上,选用培养时间、酶反应底物pH值、酶反应温度进行三因素三水平正交试验,分别测定内切葡聚糖酶、-葡萄糖苷酶活力,酶活力单位为U/mL,内切葡聚糖酶活力正交设计见表1,-葡萄糖苷酶活力正交设计见表2。取最佳组合条件做验证性试验,比较结果,确定最佳酶作用条件。表1内切葡聚糖酶活力因素水平表Table 1 factor levels of Endoglucanase activityAC水平(培养时间)/h124236348表2-葡萄糖苷酶活力因素水平表Table2factor level of-glucosidase activit
13、yA水平(培养时间)/h1242363481.3.4酶活力测定方法发酵液于4、6 0 0 0 r/min离心10 min,上清液即为粗酶液。采用DNS法 16-17 测定酶活力:取3支干燥洁净的2 0 mL具塞刻度试管,分别在试管中加人0.5mL粗酶液和1.5mL反应底物(内切葡聚糖酶活力测定采用羧甲基纤维素钠溶液;-葡萄糖苷酶活力测定采用水杨苷溶液),同时另取一组已灭活的粗酶液作为B(pH值)4.05.06.0B(pH 值)5.06.07.0(温度)/405060(温度)/405060研究报告空白对照。50 水浴30 min后,立即向试管中各加用;在30、37 均能生长,但37 下生长较为缓
14、人2 mLDNS溶液,充分摇匀后沸水浴5min,冷却后慢;该菌可在含有0 10%NaCl溶液的培养基中生用蒸馏水定容至2 0 mL,充分混匀。在540 nm波长长;可分解明胶、淀粉。下测定各试管溶液的OD值,根据葡萄糖标准曲线查表4生理生化试验结果相应的葡萄糖量,并计算相应的酶活力。Table 4Physiological and biochemical test results反应底物的制备:0.5g羧甲基纤维素钠(即生理生化试验1.0g水杨苷)定容到10 0 mL乙酸-乙酸钠缓冲液乙酸钠、甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、海碳源利用(0.2 mol/L pH 4.5)中。藻糖、肌醇、木糖、乳
15、糖、蔗糖、果糖、甘油在特定温度、特定pH值条件下,每分钟内催化底天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苏氨氮源利用酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、物产生1g还原糖所需要的酶量定义为1个酶活力缬氨酸单位(U),计算如公式(1)所示:4温度耐受30酶活力(U/mL)=PV。1 0 0 0(1)txV式中:p,对照葡萄糖标准曲线得到的葡萄糖质量浓度,mg/mL;V。,反应体积,mL;t,反应时间,min;V,粗酶液体积,mL。1.4数据处理实验均平行测定3次,数据以平均值标准差表示,采用Excel软件处理数据,运用SPSS22进行单因素ANOVA分析,并使用Duncans法进行多重比较,P
16、0.05表示差异显著,数值后标注不同小写字母表明差异性显著。正交试验结果采用极差分析法确定最优的组合。采用Origin2021软件绘制柱状图,运用MEGA6软件,Neighbor-Joining法构建系统发育树。2结果与分析2.1产酶菌株筛选结果从晒醋醋酪中筛选出1株丝状真菌,命名为CPM,通过将单菌落点接于羧甲基纤维素钠琼脂培养基进行培养,并进行产纤维素酶活力检测,菌落1、2、3周围形成无色晕圈,如表3所示菌圈比分别为2.610.14、2.7 2 0.13、2.6 9 0.0 5,初步确定该菌具有降解纤维素的能力 8 。因此,选择该菌株进行后续实验。表3菌株菌圈比Table 3Ratio o
17、f bacterial ring菌落透明圈直径D/cm13.67 0.0524.34 0.0434.64 0.042.2菌株生理生化试验及形态特征结果生理生化试验结果见表4,本研究选用12 种碳源、11种氮源培养基培养菌株CPM,发现其均可利条件37 盐耐受NaCl溶液质量分数0 10%明胶水解淀粉水解如图1-a所示,于PDA培养基30 条件培养,48h后菌落呈疏松的絮状,白色,边界不清晰;7 2 h后铺满平皿,成熟菌丝转变为黄色到不同程度灰色。ab图1菌株CPM菌落、孢子囊及孢子形态Fig.1 Colony,sporangium and spore morphology of CPM str
18、ain由图1-b可看出孢子囊表面光滑呈球形,孢子表面光滑呈椭圆形。根据文献19-2 0 初步鉴定该菌为真菌界、毛霉门(Mucoromycota)、毛霉纲(Mucora-菌落直径d/cmD/d1.43 0.062.61 0.141.65 0.062.72 0.131.72 0.022.69 0.05试验结果+一+(较弱)+48h72ha-菌落形态;b-孢子囊及孢子形态ceae)、毛霉目(Mucorales)、横梗霉属(Lichtheimia)。2.3菌株分子生物学鉴定建立系统发育树,比较菌株之间的同源性,如图2所示,菌株CPM与横梗霉菌(Lichtheimia ramosa)同源性较高。结合菌株
19、形态学观察、生理生化分析,初步认定该菌为横梗霉菌(Lichtheimia ramosa)。2023 年第49 卷第17 期(总第48 5期)239y=1.4546x-0.008,R=0.9991。如图3-a所示,食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESLichtheimia ramosa strainAS-A2(HQ285633.1)Lichtheimia ramosa strain WJ-A1(HQ285693.1)94Lichtheimia ramosa D35097Fukushima2241 genes(LC643024.1)Lichtheimiaramo
20、sa isolateFBKL3.0124(KY828877.1)CPMActinomucor:elegans strainZZZJ29(MT449965.1)Uncultured Lichtheimia clone HHQZ-56(KF984338.1)Lichtheimia ramosa strain DG-C1(HQ285641.1)68Lichtheinia corymbifera strain SEJ-A1(HQ285680.1)Lichtheimia ramosa strainDG-B2(HQ285640.1)Lichtheimia hongkongensis isolate(MT5
21、90592.1)0.0010图2 菌株CPM的系统发育树Fig.2Phylogenetic tree of strain CPM2.4单单因素试验结果2.4.1培养时间的优化葡萄糖标准曲线测定结果得到线性回归方程:80内切葡聚糖酶70b(Tu/n)/星6050403020上100C内切葡聚糖酶100-葡萄糖苷酶(Tu/n)/8060402002.4.3反应温度对酶活力的影响由图3-c可知,在50 条件下反应30 min时,该菌的内切葡聚糖酶、-葡萄糖苷酶活力均为最高,分别为(9 7.8 50.9 2)和(49.2 2 0.6 1)U/mL;60条件下反应30 min仍有较高的酶活力,说明内切葡
22、聚糖酶、-葡萄糖苷酶有一定的耐高温特性,但是比50下的酶活力低,可见反应温度太高依然会降低酶活力;4反应30 min条件下酶活力最低,内切葡聚糖酶酶活力为(2 8.57 0.7 9)U/mL,-葡萄糖苷酶酶活力(19.9 10.55)U/mL,可见低温会抑制酶的活性。综上所述,内切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶402023 Vol.49 No.17(Total 485)菌株CPM的产酶效果和接种时间存在一定关系。接种量为5%,培养36 h时,内切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶的酶活力最高,分别为(7 6.8 6 0.43)、(44.550.22)U/m L。当培养时间BC,培养时间影响最大,其次是pH值和13
23、温度;通过比较均值K,得到最佳组合为A,B,C3,即培14养时间2 4h、反应底物pH5.0、反应温度6 0;通过1516比较酶活力可知试验2 的酶活力最大,达(9 5.9 2 170.99)U/mL。18Ki表5内切葡聚糖酶活力正交试验结果K2Table 5(Orthogonal test results of endoglucanase activityA内切葡聚糖酶活试验号(培养时间)/h(p H 值)(温度)/124224324436536636748848948K185.98K274.15K365.66R20.03最优水平A1最佳组合1主次关系-葡萄糖苷酶活力正交试验结果如表6 所示
24、。经极差分析,可知对-葡萄糖苷酶活力影响的主次关系为CAB,温度影响最大,其次是培养时间和pH值;通过比较均值K,得到最佳组合为A;BC,即培养时间2 4h、反应底物pH5.0、反应温度50;通过比较酶活力可知试验11的酶活力最大,达(47.57 3.66)U/mL。2.6验证性试验按正交试验结果,取最佳组合1(A,B,C,)测定内切葡聚糖酶活力,最佳组合2(A,B,C2)测定-葡萄糖苷酶活力,试验重复3次。结果如表7 所示,正交试验2 号的内切葡聚糖酶活力高于最佳组合1,正交试验11号的-葡萄糖苷酶活力高于最佳组合2。故内切葡聚糖酶最优的酶作用条件为A,B,C2,即培养时间2 4h、反应底物
25、pH5.0、反应温度50;-葡萄糖苷酶最优的酶作用条件为A;B,C2,即培养时间2 4h、反应底物pH6.0、反应温度50。A24242436363648484841.1334.47K;30.14BC力/(U/mL)4.0405.0506.0604.0505.0606.0404.0605.0406.05066.5572.8282.5373.8276.7179.1415.986.32B2C3A,B2C3ABCB5.06.07.05.06.07.05.06.07.037.8035.3632.58R10.99最优水平Ai77.09 1.50b最佳组合295.92 0.99a主次关系84.92 1.3
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 一株产 纤维素酶 菌株 分离 纯化 及其 性质 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。