淫羊藿苷对MC3T3-E1增殖及成骨分化的影响研究.pdf
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1、口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 219 淫羊藿苷对MC3T3-E1增殖及成骨分化的影响研究钱虹静,刘钰莲,张云鹏,师一鸣,黄光辉,周也然,罗光明(昆明医科大学口腔医学院/医院,云南省口腔医学院重点实验室,云南昆明650106)摘要 目的:研究传统中药淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷(icariin,ICA)对小鼠颅顶前成骨细胞(preosteoblasts in mice calvarium,MC3T3-E1)的细胞活性及成骨分化的影响
2、。方法:筛选出 ICA 的最佳干预浓度,将 MC3T3-E1 细胞分为空白对照组及不同浓度的实验组,实验组以含 10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L 的 ICA 完全培养液分别处理 MC3T3-E1细胞。分别于培养 2、4、6 d 后用 CCK8 试剂盒检测 MC3T3-E1 细胞增殖能力;于培养 3、6、9 d 后用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测其 ALP 活性;根据检测结果,分别用完全培养液、成骨诱导液、含 10-7 mol/L 的 ICA 完全培养液处理 MC3T3-E1 细胞 21 d 后,再分别作茜素红染色。结果:与空
3、白对照组相比,药物处理组明显抑制了 MC3T3-E1 细胞的增殖,但促进了 MC3T3-E1 细胞的 ALP 活性;而不同浓度的 ICA 培养的细胞对其钙结节的形成影响不明显。结论:在我们的实验条件下,ICA 可能抑制了 MC3T3-E1 细胞的增殖,促进了 MC3T3-E1 细胞的成骨分化。关键词淫羊藿苷;小鼠颅顶前成骨细胞;增殖;成骨分化中图分类号 R782 文献标志码 ADOI:10.12439/kqhm.1005-4979.2023.04.003 Icariin on the proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E
4、1:An experimental studyQIAN Hongjing,LIU Yulian,ZHANG Yunpeng,SHI Yiming,HUANG Guanghui,ZHOU Yeran,LUO Guangming(School and Hospital of Stomatology,Kunming Medical University,Yunnan Key Laboratory of Stomatology,Kunming 650106,Yunnan Province,China)Abstract Objective:To study the effects of a Chines
5、e traditional medicine icariin(ICA)on the cell activity and osteogenic differentiation of preosteoblasts in mice calvarium(MC3T3-E1).Methods:The optimal intervention concentration of ICA was screened and MC3T3-E1 cells were divided into blank control group and experimental group with different conce
6、ntrations of ICA.MC3T3-E1 cells were treated with ICA complete medium containing 10-9,10-8,10-7,10-6 and 10-5 mol/L.On days 2,4 and 6,the proliferation of MC3T3-E1 cells was detected by CCK8 kit,and the ALP activity was detected by alkaline phosphatase(ALP)kit on days 3,6 and 9;MC3T3-E1 cells were t
7、reated with 10-7 mol/L ICA complete medium for 21 days.Alizarin red(AR)staining was used to determine the formation of calcium nodules.Results:Compared with the blank control group,the drug treatment group significantly inhibited the proliferation of MC3T3-E1 cells,but promoted the ALP activity of M
8、C3T3-E1 cells;however,different concentrations of ICA had no significant effect on the formation of calcium nodules in cultured cells.Conclusion:Under our experimental conditions,ICA may inhibit the proliferation of MC3T3-E1 cells and promote osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells.Keywordsicar
9、iin;MC3T3-E1 cells;proliferation;osteogenic differentiation收稿日期:2021-12-10接受日期:2022-10-11基金项目:昆明医科大学 2020 年大学生创新性实验计划项目(2020JXD245);2020 年云南省科技厅昆明医科大学应用基础研究联合专项(202001AY070001-248)作者简介:钱虹静,学士.E-mail:通信作者:罗光明,副主任医师.E-mail:基础研究本草纲目中所论及淫羊藿的功效主要是补骨、益气、壮精。研究1-4证实,淫羊藿的主要活性成分之一是淫羊藿苷(ICA),其具有多种生物活性,包括抗氧化、抗癌
10、活性,特别是在骨改建中,具有明显的抗骨质疏松效应,能够增强成骨细胞的分化和增殖,促进骨基质钙化,并能定向性促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。ICA 促进成骨分化并抑制其成脂分化的作用机制可能通过激活 MEK/ERK、PI3K/Akt/eNOS、hoA-TAZ 途径而发挥潜在性成骨效应5;ICA 亦可能通过抑制 p38 和 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活性,或通过口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August
11、,2023 220 调整 BMP-2/Smad4 信号转导途径调控成骨细胞的骨形成过程 6-7。本实验主要研究不同浓度的 ICA 对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1)的细胞活性及细胞成骨分化的影响。1材料和方法1.1主要材料MC3T3-E1 细胞由昆明医科大学口腔医学院提供;ICA(图 1)(上海同田生物技术股份有限公司,中国);DMEM 培养液(Gibco 公司,美国);胎牛血清(Gibco 公司,美国);双抗(BI 公司,德国);CCK8试剂盒(美伦生物技术有限公司,中国);碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,中国);茜素红染液(北京索莱宝科技有限公司,中国);MC
12、3T3-E1 细胞成骨诱导分化培养液(赛业生物科技有限公司,中国)。培养液作同步化处理。继续培养 24 h,吸弃原培养液,每孔加入含 CCK8(每孔 10 L)的完全培养液100 L,在 5%CO2、37 条件下继续行细胞培养孵育 1 h。将其置于酶标仪上,测定 450 nm 波长处的零点吸光度值。再分别换含浓度梯度 10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L 的 ICA 完全培养液培养,每种浓度平行做 6 个复孔,空白对照组为完全培养液。分别培养 2、4、6 d 后测定 450 nm 波长处的吸光度值。对加药后第 2、4、6 天所测得的吸光度值除以零点吸光度值所得增殖倍数值
13、作统计学处理。1.4不同浓度 ICA 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响1.4.1ICA 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的 ALP 活性测定将 P4 代小鼠 MC3T3-E1 细胞以 2105个/孔的密度接种至 6 孔板中,细胞贴壁后分别加入含10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L 的 ICA 培 养 液 2 mL进行培养,空白对照组中加入等量完全培养液培养。分别于培养后 3、6、9 d 时收样:先吸尽培养液,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗 2 遍,加入 0.1 mL 0.2%Triton X-100,刮尽贴壁细
14、胞,收集细胞悬液于 EP 管中,搅匀后于 4 下孵育 10 min;然后 4 下以 2 500g 离心 10 min,取上清液做 ALP 活性测定。按照 ALP 试剂盒说明检测 405 nm 处的吸光度值,然后根据试剂盒说明计算ALP活性(单位:U/L)。将所得数据进行统计学处理。1.4.2钙化结节形成的测定选取 10-7 mol/L 的ICA 处理 MC3T3-E1 细胞。取 P4 代小鼠 MC3T3-E1细胞,以 3105个/mL 的密度接种于 6 孔板中,细胞汇合度达到 80%后进行分组:空白对照组:加入完全培养液;阳性对照组:加入成骨诱导液(osteogenic medium,OM);
15、药物处理组:加入含适宜浓度 ICA(根据 CCK8 及 ALP 检测结果选取适宜浓度)的完全培养液。每 3 d 换液 1 次,21 d 后吸尽原培养液,PBS 清洗 1 次后用 4%的多聚甲醛固定30 min,继续用PBS清洗2遍后行茜素红染色,然后用 PBS 清洗 3 遍,以去除残留的染色液,并在光学显微镜下捕获图片后对其进行观察分析。1.5统计学处理采用 SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均数 标准差(xs)表示,多组间差异采用单因素方差分析,2 组间比较采用 t检验,以 P0.05 为差异有统计学意义。?ICA 分子量:676.65 Da;化学式:C33H4
16、0O15。图 1ICA 的化学结构式Figure 1Chemical structure of ICA1.2MC3T3-E1 细胞的培养将冷冻管从液氮罐中取出,迅速放入 37 水浴中,并不时摇动,在 1 min 内使其完全融化,无菌操作下取出细胞;以 1 000 r/min 离心 3 min,弃去上层液。加入适量培养液重悬后将其接种于 T25 的培养瓶中,置于 37、5%CO2的培养箱中培养,24 h 后观察细胞贴壁情况并换液继续培养。每隔 2 d 换液,待细胞汇合度达 80%90%时用胰蛋白酶消化 1 min后进行传代。1.3不同浓度的 ICA 对 MC3T3-E1 细胞增殖的影响取 P4
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