淫羊藿苷对MC3T3-E1增殖及成骨分化的影响研究.pdf

口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 219 淫羊藿苷对MC3T3-E1增殖及成骨分化的影响研究钱虹静，刘钰莲，张云鹏，师一鸣，黄光辉，周也然，罗光明（昆明医科大学口腔医学院/医院，云南省口腔医学院重点实验室，云南昆明650106）摘要 目的：研究传统中药淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷（icariin，ICA）对小鼠颅顶前成骨细胞（preosteoblasts in mice calvarium，MC3T3-E1)的细胞活性及成骨分化的影响。方法：筛选出 ICA 的最佳干预浓度，将 MC3T3-E1 细胞分为空白对照组及不同浓度的实验组，实验组以含 10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L 的 ICA 完全培养液分别处理 MC3T3-E1细胞。分别于培养 2、4、6 d 后用 CCK8 试剂盒检测 MC3T3-E1 细胞增殖能力；于培养 3、6、9 d 后用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒检测其 ALP 活性；根据检测结果，分别用完全培养液、成骨诱导液、含 10-7 mol/L 的 ICA 完全培养液处理 MC3T3-E1 细胞 21 d 后，再分别作茜素红染色。结果：与空白对照组相比，药物处理组明显抑制了 MC3T3-E1 细胞的增殖，但促进了 MC3T3-E1 细胞的 ALP 活性；而不同浓度的 ICA 培养的细胞对其钙结节的形成影响不明显。结论：在我们的实验条件下，ICA 可能抑制了 MC3T3-E1 细胞的增殖，促进了 MC3T3-E1 细胞的成骨分化。关键词淫羊藿苷；小鼠颅顶前成骨细胞；增殖；成骨分化中图分类号 R782 文献标志码 ADOI：10.12439/kqhm.1005-4979.2023.04.003 Icariin on the proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1:An experimental studyQIAN Hongjing,LIU Yulian,ZHANG Yunpeng,SHI Yiming,HUANG Guanghui,ZHOU Yeran,LUO Guangming(School and Hospital of Stomatology,Kunming Medical University,Yunnan Key Laboratory of Stomatology,Kunming 650106,Yunnan Province,China)Abstract Objective:To study the effects of a Chinese traditional medicine icariin(ICA)on the cell activity and osteogenic differentiation of preosteoblasts in mice calvarium(MC3T3-E1).Methods:The optimal intervention concentration of ICA was screened and MC3T3-E1 cells were divided into blank control group and experimental group with different concentrations of ICA.MC3T3-E1 cells were treated with ICA complete medium containing 10-9,10-8,10-7,10-6 and 10-5 mol/L.On days 2,4 and 6,the proliferation of MC3T3-E1 cells was detected by CCK8 kit,and the ALP activity was detected by alkaline phosphatase(ALP)kit on days 3,6 and 9;MC3T3-E1 cells were treated with 10-7 mol/L ICA complete medium for 21 days.Alizarin red(AR)staining was used to determine the formation of calcium nodules.Results:Compared with the blank control group,the drug treatment group significantly inhibited the proliferation of MC3T3-E1 cells,but promoted the ALP activity of MC3T3-E1 cells;however,different concentrations of ICA had no significant effect on the formation of calcium nodules in cultured cells.Conclusion:Under our experimental conditions,ICA may inhibit the proliferation of MC3T3-E1 cells and promote osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells.Keywordsicariin;MC3T3-E1 cells;proliferation;osteogenic differentiation收稿日期：2021-12-10接受日期：2022-10-11基金项目：昆明医科大学 2020 年大学生创新性实验计划项目（2020JXD245）；2020 年云南省科技厅昆明医科大学应用基础研究联合专项（202001AY070001-248）作者简介：钱虹静，学士.E-mail：通信作者：罗光明，副主任医师.E-mail：基础研究本草纲目中所论及淫羊藿的功效主要是补骨、益气、壮精。研究1-4证实，淫羊藿的主要活性成分之一是淫羊藿苷(ICA)，其具有多种生物活性，包括抗氧化、抗癌活性，特别是在骨改建中，具有明显的抗骨质疏松效应，能够增强成骨细胞的分化和增殖，促进骨基质钙化，并能定向性促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。ICA 促进成骨分化并抑制其成脂分化的作用机制可能通过激活 MEK/ERK、PI3K/Akt/eNOS、hoA-TAZ 途径而发挥潜在性成骨效应5；ICA 亦可能通过抑制 p38 和 c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）活性，或通过口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 220 调整 BMP-2/Smad4 信号转导途径调控成骨细胞的骨形成过程 6-7。本实验主要研究不同浓度的 ICA 对小鼠颅顶前成骨细胞（MC3T3-E1)的细胞活性及细胞成骨分化的影响。1材料和方法1.1主要材料MC3T3-E1 细胞由昆明医科大学口腔医学院提供；ICA（图 1）（上海同田生物技术股份有限公司，中国)；DMEM 培养液（Gibco 公司，美国）；胎牛血清（Gibco 公司，美国）；双抗（BI 公司，德国）；CCK8试剂盒（美伦生物技术有限公司，中国）；碱性磷酸酶（ALP)试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，中国）；茜素红染液（北京索莱宝科技有限公司，中国）；MC3T3-E1 细胞成骨诱导分化培养液（赛业生物科技有限公司，中国）。培养液作同步化处理。继续培养 24 h，吸弃原培养液，每孔加入含 CCK8（每孔 10 L）的完全培养液100 L，在 5%CO2、37 条件下继续行细胞培养孵育 1 h。将其置于酶标仪上，测定 450 nm 波长处的零点吸光度值。再分别换含浓度梯度 10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L 的 ICA 完全培养液培养，每种浓度平行做 6 个复孔,空白对照组为完全培养液。分别培养 2、4、6 d 后测定 450 nm 波长处的吸光度值。对加药后第 2、4、6 天所测得的吸光度值除以零点吸光度值所得增殖倍数值作统计学处理。1.4不同浓度 ICA 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响1.4.1ICA 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的 ALP 活性测定将 P4 代小鼠 MC3T3-E1 细胞以 2105个/孔的密度接种至 6 孔板中，细胞贴壁后分别加入含10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L 的 ICA 培 养 液 2 mL进行培养，空白对照组中加入等量完全培养液培养。分别于培养后 3、6、9 d 时收样：先吸尽培养液，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗 2 遍，加入 0.1 mL 0.2%Triton X-100，刮尽贴壁细胞，收集细胞悬液于 EP 管中，搅匀后于 4 下孵育 10 min；然后 4 下以 2 500g 离心 10 min，取上清液做 ALP 活性测定。按照 ALP 试剂盒说明检测 405 nm 处的吸光度值，然后根据试剂盒说明计算ALP活性（单位:U/L）。将所得数据进行统计学处理。1.4.2钙化结节形成的测定选取 10-7 mol/L 的ICA 处理 MC3T3-E1 细胞。取 P4 代小鼠 MC3T3-E1细胞，以 3105个/mL 的密度接种于 6 孔板中，细胞汇合度达到 80%后进行分组：空白对照组:加入完全培养液；阳性对照组:加入成骨诱导液(osteogenic medium，OM)；药物处理组：加入含适宜浓度 ICA（根据 CCK8 及 ALP 检测结果选取适宜浓度）的完全培养液。每 3 d 换液 1 次，21 d 后吸尽原培养液，PBS 清洗 1 次后用 4%的多聚甲醛固定30 min，继续用PBS清洗2遍后行茜素红染色，然后用 PBS 清洗 3 遍，以去除残留的染色液，并在光学显微镜下捕获图片后对其进行观察分析。1.5统计学处理采用 SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均数 标准差（xs）表示，多组间差异采用单因素方差分析，2 组间比较采用 t检验，以 P0.05 为差异有统计学意义。?ICA 分子量：676.65 Da；化学式：C33H40O15。图 1ICA 的化学结构式Figure 1Chemical structure of ICA1.2MC3T3-E1 细胞的培养将冷冻管从液氮罐中取出，迅速放入 37 水浴中，并不时摇动，在 1 min 内使其完全融化，无菌操作下取出细胞；以 1 000 r/min 离心 3 min，弃去上层液。加入适量培养液重悬后将其接种于 T25 的培养瓶中，置于 37、5%CO2的培养箱中培养，24 h 后观察细胞贴壁情况并换液继续培养。每隔 2 d 换液，待细胞汇合度达 80%90%时用胰蛋白酶消化 1 min后进行传代。1.3不同浓度的 ICA 对 MC3T3-E1 细胞增殖的影响取 P4 代小鼠 MC3T3-E1 对数生长期细胞，以 3 000 个/孔的密度接种于 96 孔板中。接种 24 h 后，MC3T3-E1 细胞贴壁后更换不含胎牛血清的 DMEM口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 221 抑制，浓度为 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L 的 ICA 与空白对照组相比，差异有统计学意义（P0.05）；第 6 天时，10-6 mol/L 组抑制最明显，与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P0.05）。详见图 3。2结果2.1MC3T3-E1 细胞的形态学观察接种后 1 d，细胞呈多角形、不规则形（图 2A）；接种后 23 d，细胞多为梭形贴壁生长（图 2B、C）。2.2不同浓度的 ICA 对 MC3T3-E1 细胞增殖的影响第 2 天时，MC3T3-E1 细胞的增殖明显受到了2.3不同浓度的 ICA 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响2.3.1ICA 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的 ALP 活性测定与空白对照组相比，第 3 天时，不同药物浓度的实验组显著促进了 MC3T3-E1 细胞的 ALP 活性，其中，10-9、10-8、10-6 mol/L 组的促进作用比其他2 组高，且差异有统计学意义（P0.01）；第 6 天时，相对于空白对照组，10-9（P0.01）、10-8 mol/L 组的ALP活性下降，而10-7、10-6、10-5 mol/L组的ALP活性 增加；第 9 天时，相对于空白对照组，10-9、10-8 mol/L组的 ALP 活性显著增加，且 10-8 mol/L 组差异有统计学意义（P0.01），其余 3 组 ALP 活性增加不明显。考虑 ALP 活性的改变与 ICA 的浓度及处理时间的长短均有关，当用浓度小于 10-6 mol/L 的 ICA 处理MC3T3-E1 细胞时，ALP 活性随处理时间（大于 6 d时）的增加而降低。详见图 4。A.细胞接种后 1 d；B.细胞接种后 2 d；C.细胞接种后 3 d，细胞数目较多。图 2MC3T3-E1 细胞的细胞形态（20）Figure 2Cell morphology of MC3T3-E1 cells（20）?*表示 P0.01，*表示 P0.001，与空白对照组比较。图 3ICA 对 MC3T3-E1 细胞增殖的影响Figure 3Effects of ICA on MC3T3-E1 cells proliferation?*表示 P0.01，与空白对照组比较。图 4MC3T3-E1 细胞的 ALP 活性测定Figure 4Determination of ALP activity of MC3T3-E1 cells2.3.2钙化结节形成的测定与空白对照组相比较，阳性对照组有较为明显的钙结节形成，药物处理组钙结节形成不明显（图 5）。口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 222 3讨论从中医学角度来看，骨的生长发育与肾的功能状态密切相关。淫羊藿为小檗科（Berberidaceae）植物属，其主要活性成分 ICA 为 8-异戊烯基黄酮苷类化合物。有研究8-10证实，黄酮苷类化合物均具有成骨的生物学效应。骨组织工程诸多领域研究中，MC3T3-E1 细胞由于其明确的成骨分化生物学特性而成为研究焦点11-12。ALP 为体液中广泛存在的单酯磷酸酶，它为成骨细胞所合成及分泌。因此，ALP 活性是成骨细胞代谢活性的直接反映 13-14。在我们的实验中，ICA 可能抑制了 MC3T3-E1细胞的增殖、促进了 MC3T3-E1 细胞的分化。这可能是由于在细胞的增殖和分化过程中，增殖和分化往往是互相影响的。处于增殖中的细胞分化能力降低，分化中的细胞增殖能力也往往降低15。该结果与陈旭凤等16等的研究结果类似。钙化结节的形成是成骨细胞的独特标志。不同浓度的 ICA 对 ALP 活性有一定的促进作用，ALP 活性与钙结节的形成相关。本实验显示，相较于其他浓度，10-7 mol/L 的 ICA 对细胞 ALP 活性在每个时间段均有稳定且明显的促进作用。根据以往文献17 数据，与对照组相比，10-7 mol/L 药物处理组促进钙结节形成不明显，为探究该浓度是否会抑制钙结节的形成，我们利用 10-7 mol/L 的 ICA 处理 MC3T3-E1细胞 21 d 后进行茜素红染色，发现阳性对照组较空白对照组有更多的钙化结节出现，而 ICA 处理组钙化结节尚不明显。考虑原因：可能与细胞的状态、实验操作技巧等因素有关；另外，药物处理时间、药物浓度等都可影响实验结果，故 ICA 成骨效应及机制尚须行进一步研究。综上所述，在我们的实验条件下，ICA 可能抑制了 MC3T3-E1 细胞的增殖及促进了 MC3T3-E1细胞的成骨分化。参考文献：1 Wang ZY,Liu JG,Li H,et 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4979。本刊坚持理论与实践相结合，报道口腔颌面外科及相关学科领域的基础研究、临床研究、口腔种植学研究、临床总结、综述、病例报告。本刊为中国科技核心期刊，已被中国学术期刊综合评价数据库中国核心期刊（遴选）数据库中国期刊全文数据库中文科技期刊数据库、美国 化学文摘（CA）、美国 乌利希期刊指南 等收录。口腔颌面外科杂志 可通过全国各地邮政局订阅，邮发代号 4 532，双月刊，每期定价 12 元，全年 72 元。错过邮政局征订时间的读者，也可由本刊编辑部代办邮购，免收平邮邮费。欢迎投稿！欢迎订阅！地址：上海市共和新路 1238 号，邮编：200070 网址：http：/（可在线投稿、审稿）电话：[phone] E-mail：omsj399 口腔颌面外科杂志 编辑部