一株海洋真菌与细菌共培养次级代谢产物的研究.pdf
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1、生命科学版),2023,44(4):8 4-8 9.引文格式:朱夏濠,郝宝聪,郑株海洋真菌与细菌共培养次级代谢产物的研究J.扬州大学学报(农业与杨,等.Jul.2023Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2023年7 月Vol.44 No.4第44卷第4期扬州大学学报(农业与生命科学版)DOI:10.16872/ki.1671-4652.2023.04.011一株海洋真菌与细菌共培养次级代谢产物的研究朱夏濠,郝宝聪,郑杨,李申奥,徐奥翔,王梦如,陈敏(扬州大学环境科学与工程学院,江苏扬州2 2
2、 512 7)摘要:对海洋真菌PenicilliumjanthinellumHK1-6与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)A T CC43300共培养的次级代谢产物进行分离纯化与结构鉴定,综合运用多种色谱方法从共培养发酵产物中分离得到5个化合物,采用NMR等光谱方法并参照文献将其分别鉴定为吲哚-3-乙酸(1)、青霉酸(2)、diorcinol(3)、o r c i n o l(4)和para-herquanideN(5)。同时采用质谱-分子网络及GNPS平台技术鉴定了3个吲哚生物碱类化合物notoamideB(6)、p a r a-herquanideF(7)
3、和paraherquamideE(8)。该研究表明,共培养是激活微生物沉默基因簇,发现抗生素类化合物的一种有效方法。关键词:海洋真菌;细菌;共培养;次级代谢产物;分子网络;吲哚生物碱中图分类号:S154.39;R37 8.1+1文献标志码:A文章编号:16 7 1-46 52(2 0 2 3)0 4-0 0 8 4-0 6Research on secondary metabolites of a marine-derivedfungus co-cultured with a bacteriaZHU Xiahao,HAO Baocong,ZHENG Yang,LI Shenao,XU Aoxi
4、ang,WANG Mengru,CHEN Min(College of Environmental Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China)ABSTRACT:Five secondary metabolites were isolated from the co-culture fermentation products of the marine-derivedfungus Penicillium janthinellum HK1-6 and the methicillin-resistant Sta
5、phylococcus aureus ATCC 43300 by comprehen-sive use of chromatographic methods.These compounds were determined as indole-3-acetic acid(1),penicillic acid(2),diorcinol(3),orcinol(4),and paraherquanide N(5)by detailed analysis of the NMR spectroscopic data and by compari-son with data reported in the
6、literatures.Three indole alkaloids,including notoamide B(6),paraherquanides F(7),andE(8),were identified by using mass spectrometry-molecular network and GNPS platform techniques.This study indicatesthat co-culture is an effective method for activating microbial silencing gene clusters and discoveri
7、ng antibiotic compounds.KEY WORDS:marine-derivedfungus;bacteria;co-culture;secondary metabolites;molecular network;indole alkaloid海洋微生物,尤其是海洋真菌,是获得结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物的重要来源,为海洋药物先导化合物的筛选和发现提供了丰富的活性模板分子。然而,随着对海洋真菌研究的不断深入,部分菌株被重复研究,已知化合物的重复分离率逐渐增加,新化合物的发现概率逐年降低。研究2 表明,在传统的试验培养条件下,微生物只进行一些常规基因的表达,其体内大部分编
8、码化合物的基因是处于沉默状态的。因此,为从微生物中分离得到更多的结构新颖的化合物,就必须想方设法激活微生物的沉默基因。共培养策略是利用微生物群落中的种间相互作用,来激发微生物沉默基因簇表达的一种直接有效且简便易行的方法3-4。本研究采用共培养技术,将海洋真菌Penicillium janthinellumHK1-6与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)A T CC4330 0 共培养,并对其共培养次级代谢产物进行分离与结构鉴定,为新型抗生素类化合物的发现提供有效方法。收稿日期:2 0 2 2-0 6-10基金项目:国家自然科学基金资助项目(8 17 0 3411
9、)作者简介:朱夏濠(1998 一),男,江苏南通人,扬州大学硕士研究生,主要从事海洋天然产物化学研究。*通信作者,陈敏,扬州大学副教授、硕导,主要从事海洋天然产物化学研究;E-mail:d i e y i n g 0 7 19 16 3.c o m。85朱夏濠等:第4期株海洋真菌与细菌共培养次级代谢产物的研究1材料与方法1.1仪器与试剂MicromassQ-TOF高分辨质谱仪(美国Waters公司);BrukeramazonSL离子阱液质联用仪(德国BRUKER公司);AVANCE600/400核磁共振仪(德国BRUKER公司);WTF-203B暗箱式紫外分析仪(上海精科实业有限公司);KQ-
10、250E超声波清洗器(昆山市超声仪器公司);QYC-2112B双层摇床(上海沪粤明科学仪器公司);CR21GIII超高速低温冷冻离心机(日本HITACHI公司);L-2000高效液相色谱仪(HPLC)(日本HITACHI公司)。硅胶薄层层析板(烟台江友硅胶开发公司);柱层析硅胶48 7 5m(青岛海洋化工公司);SephadexLH-20(美国AmershamBiosciences公司);ODS反相硅胶(香港优尼康公司);色谱纯甲醇(天津四友精细化学品公司)。1.2菌株来源海洋真菌HK1-6分离于海南东寨港红树林自然保护区的海桑根际土壤样品,经分子生物学及形态学鉴定为微紫青霉(Penicill
11、ium janthinellum)5,G e n Ba n k 登录号为KY412802。真菌P.janthinel-lumHK1-6与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureus)A T CC4330 0 均保存于扬州大学海洋科学与技术研究所。1.3发酵、提取与分离1)发酵:采用PDB-LB培养基(每1L纯净水中加人10 g葡萄糖,10 0 g土豆浸出液,2.5g酵母膏,15g海盐,5g蛋白陈,2.5gNaCl,p H 7.0)进行发酵,每40 0 mL培养基中接种1mL真菌以及接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(吸光度为0.5)2 0 0 L,共发酵液15L,于2 8 摇床(140 rmin-1)
12、上培养2 周。2)提取:利用超高速低温冷冻离心机对菌体与发酵液进行分离(8 0 0 0 rmin-1离心5min),取上清发酵液,用等体积的乙酸乙酯萃取3次,减压浓缩后得到乙酸乙酯提取物7.5g。3)分离:上述提取物采用减压硅胶柱层析,以石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇为溶剂进行梯度洗脱,分为12 个组分(Fr.1一Fr.12),再经反复的正、反相硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析及HPLC分离纯化,最终分别从Fr.2中分离得到化合物4(6.3mg);从Fr.3中分离得到化合物3(12.1mg);从Fr.4中分离得到化合物2(2.3mg);从Fr.6中分离得到化合物1(9.2 mg)
13、和化合物5(12.0 mg)。1.4LC-MS/MS测试与分子网络分析采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪对提取物进行检测。色谱柱为YMC-Park-Ci8column(5m,2 50 mmX4.6 mm)。流动相为甲醇与水,流速为0.8 mLmin-1,梯度洗脱条件如下:0 7 min,30%70%甲醇;7 14min,7 0%8 5%甲醇;14 2 0 min,8 5%90%甲醇;2 0 2 5min,90%95%甲醇;2 52 7 min,95%甲醇。进样量为8 L。质谱采用正离子模式,离子源为ESI源。将mzXML格式的质谱数据上传至GNPS分子网络平台构建分子网络。具体参数设置:前体
14、离子质量误差值2.0 Da,碎片离子质量误差值0.5Da,匹配的二级质谱碎片峰6,节点之间相关余弦值0.7。最终生成的质谱分子网络图借助Cytoscape软件实现可视化。2结果与分析2.1化合物结构鉴定化合物1为白色粉末。其核磁共振氢谱(HNMR)和碳谱(13CNMR)表明结构中含有一个吲哚片段及一个羧基(c173.5)。具体核磁数据如下:HNMR(40 0 M H z,D M SO-d。)10.90(1H,s,NH),7.49(1 H,d,J=8.0 H z,7-H),7.34(1 H,d,J=8.0 H z,4-H),7.2 2(1H,d,J=2.4 Hz,2-H),7.07(1H,td,
15、J=8.0,1.2 Hz,5-H),6.97(1H,td,J=8.0,1.2Hz,6-H),3.62(2H,S,10-H);13C NMR(10 0 M H z,D M SO-d.)8 c 17 3.5(C,C-1),136.1(C,C-9),12 7.3(C,C-8),123.9(C,C-2),121.0(CH,C-6),118.6(CH,C-7),118.4(CH,C-5),111.3(CH,C-4),86第44卷扬州大学学报(农业与生命科学版)107.8(C,C-3),31.2(CH 2,C-10)。以上波谱数据与文献6 报道基本一致,因此鉴定化合物1为吲哚-3-乙酸(indole-3-
16、aceticacid)。化合物2 为无色针状结晶化合物,核磁数据如下:HNMR(40 0 M H z,D M SO-d。)7.8 9(1H,s,4-OH),5.41(1H,brs,6-Ha),5.32(1H,b r s,6-H b),5.13(1H,s,2-H),3.8 6(3H,s,3-OCH),1.66(3H,S,H-7);13C NMR(100 MHz,DMSO-de)8c 170.4(C,C-1),140.8(C,C-5),115.9(CH2,C-6),10 2.8 (C,C-4),8 9.9(C H,C-2),6 0.2 8 (C H,O,C-8),17.56 (C H 3,,C-7
17、)。以上波谱数据与文献7 报道基本一致,因此鉴定化合物2 为青霉酸(penicillic acid)。化合物3为淡黄色油状物,是一个对称结构,核磁数据仅出现一半信号。其氢谱如下:1HNMR(400 MHz,DMSO-d。)o 11.48 (2 H,S,3-O H,3-O H),6.8 3(2 H,b r s,2-H,2 -H),6.59(2 H,brs,4-H,4-H),6.0 3(2 H,d,J=2.6 H z,6-H,6 -H),2.0 2(6 H,s,5-H,5-H)。以上波谱数据与文献8 报道基本一致,因此鉴定化合物3为二苯醚类化合物diorcinol。化合物4为棕红色油状物。其结构存
18、在对称轴,部分核磁数值重叠,具体核磁数据如下:HNMR(acetone-de,600 MHz)8n 9.03(1H,S,3-OH),6.01(1H,s,H-4),5.95(1H,s,H-2),2.15(3H,S,H-7);13C NMR(acetone-d6,150 MHz)8c 158.4(C,C-1,C-3),139.7(C,C-5),107.4(C,C-4,C-6),99.6(C,C-2),2 0.6(CH 3,C-7)。结合文献9数据,确定化合物4为苯酚类化合物orcinol。化合物4是化合物3的单体结构。化合物6 为棕色油状物。高分辨质谱HR-ESI-MS给出m/z464.2562M
19、+H+,提示分子式为C27H33N;O(C2 7 H 34N.O+理论值为46 4.2 544)。其核磁数据如下:HNMR(a c e t o n e-d e,6 0 0 M H z)Oh 7.16(1H,d,J=8.4 Hz,H-4),6.70(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.38(1H,d,J=7.8 Hz,H-24),4.98(1H,d,J=7.8 Hz,H-25),4.28(1H,brs,Ha-12),3.91(1H,brs,H a-16),3.41(1H,brs,Hb-12),3.16(1H,overlapped,H-20),3.03(1H,m,Hb-16),2.52(1H
20、,brs,Ha-10),2.42(1H,m,Ha-15),2.33(1H,brs,H b-10),2.2 4(1H,m,H a-19),2.10 (1H,m,H b-19),2.0 8(1H,m,Hb-15),1.80(1H,m,H-14),1.50(3H,s,H-17),1.43(3H,s,H-2 7),1.41(3H,s,H-28),1.14(3H,S,H-22),0.88(3H,S,H-23);13C NMR(acetone-de,150 MHz)c 182.8(C,C-2),168.6(C,C-18),147.5(C,C-6),140.0 (C H,C-2 4),136.5(C,C-7
21、),134.6 (C,C-8),125.8(C,C-9),122.1(CH,C-4),117.8(CH,C-5),116.1(C H,C-2 5),8 0.4(C,C-2 6),7 2.2(C,C-13),65.0(C,C-11),6 3.6 (C,C-3),57.6 (C H 2,C-12),53.5(C H 2,C-16),52.3(C H,C-20),46.7(C,C-21),38.5(CH2,C-15),36.0(CH2,C-10),30.6(CH3,C-2 8),30.4(C H 3,C-27),23.9(CH,C-14),23.1(CH3,C-23),20.8(CH2,C-19),
22、2 0.5(CH 3,C-2 2),12.4(CH 3,C-17)。通过与文献10 数据对比,确定该化合物为吲哚生物碱类化合物paraherquanideN。2.2化合物结构采用共培养技术,将海洋真菌P.janthinellumHK1-6与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC43300共培养,并对其共培养次级代谢产物进行分离与结构鉴定,最终获得5个化合物(图1),包括吲哚-3-乙酸(1)、青霉酸(2)、二苯醚类化合物diorcinol(3)、苯酚类化合物orcinol(4)以及吲哚生物碱类化合物paraherquanideN(5)。运用液质联用技术(LC-MS)获得共培养产物的
23、二级质谱(MS/MS),通过全球天然产物分子网络(GNPS)平台形成质谱-分子网络,又鉴定了处于吲哚生物碱类分子簇中的3个化合物勿 notoamide B(6)、p a r a h e r q u a n i d e F(7)及 paraherquamide E(8)(图 1)。2.3抗菌活性测试本课题组在前期研究11-12 中已测试化合物2 和3的抗菌活性,2 个化合物均显示出较强的抗菌活性,尤其是化合物2 显示出对S.aureusATCC43300的强抗菌活性。本研究采用滤纸片法13 测试了化合物1、4、5的抗菌活性,遗撼的是当浓度为10 0 g片-1时,3个化合物对测试菌株均没有显示出抗
24、菌活性。青87朱夏濠等:株海洋真菌与细菌共培养次级代谢产物的研究第4期161512N14101111813174HOOHHOOH321193OH333192H71068N1571155527H67H728251234245NNHHHNHHH678图1化合物1一8 的结构Fig.1Structures of compounds 1-82.4质谱-分子网络分析本研究采用基于LC-MS/MS的分子网络技术对共培养发酵产物的吲哚生物碱类化合物的化学多样性进行了重点分析,所形成的质谱-分子网络见图2。该分子网络中共含有2 57 个节点,节点数3个的分子簇有13个。经与GNPS数据库检索比对,可知部分分子
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