抑制副溶血性弧菌的乳酸菌筛选鉴定及其生物学特性研究.pdf
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1、基金项目:浙江省基础公益研究计划(编号:);浙江省生物工程重中之重学科项目(编号:);浙江省“生物工程”一流学科(类)学生创新计划项目(编号:)作者简介:于晨,女,浙江万里学院在读硕士研究生。通信作者:袁勇军(),男,浙江万里学院教授,硕士生导师,博士。:收稿日期:改回日期:犇 犗 犐:犼 狊 狆 犼 狓 文章编号 ()抑制副溶血性弧菌的乳酸菌筛选鉴定及其生物学特性研究 ,犞 犻 犫 狉 犻 狅狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊于晨犢 犝犆 犺 犲 狀杨露犢 犃犖犌犔 狌管峰犌 犝 犃犖犉 犲 狀 犵张捷犣犎犃犖犌犑 犻 犲袁勇军犢 犝犃犖犢 狅 狀 犵 犼 狌 狀
2、(浙江万里学院生物与环境学院,浙江 宁波 )(犆 狅 犾 犾 犲 犵 犲狅 犳犅 犻 狅 犾 狅 犵 犻 犮 犪 犾犪 狀 犱犈 狀 狏 犻 狉 狅 狀 犿 犲 狀 狋 犪 犾犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲 狊,犣 犺 犲 犼 犻 犪 狀 犵犠 犪 狀 犾 犻犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔,犖 犻 狀 犵 犫 狅,犣 犺 犲 犼 犻 犪 狀 犵 ,犆 犺 犻 狀 犪)摘要:目的:丰富功能性乳酸菌资源库,寻找具有副溶血性弧菌拮抗能力的优良乳酸菌出发菌株。方法:采用牛津杯抑菌试验筛选具有广谱抑菌潜力的乳酸菌菌株,通过生长代谢性能、胃肠液耐受性能、耐盐性、抗生素敏感性、抑菌谱等指标探讨其生物学特
3、性。结果:以副溶血性弧菌为指示菌,筛选得到株乳酸菌,经形态学、生理生化、分子生物学鉴定,分别归类于类干酪乳酪杆菌、发酵黏液乳杆菌和植物乳植物杆菌。其中,类干酪乳酪杆菌 抑菌活性最佳,内菌落总数超过 ,发酵液 值稳定在左右,经人工模拟胃液处理后,存活率为 ,再经人工模拟肠液处理后,存活率仍可达 ,经 胁迫处理 后,活菌总数 。同时,类干酪乳酪杆菌 细菌素粗提物对 种致病菌呈良好抑菌活性,具有广谱抑菌潜力,且对种常见抗生素未见耐药性。结论:筛选得到了能够抑制副溶血性弧菌且生物学特性优良的类干酪乳酪杆菌。关键词:副溶血性弧菌;类干酪乳酪杆菌;筛选;鉴定;生物学特性犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋:犗
4、犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲:犞 犻 犫 狉 犻 狅狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊 犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊:犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 ,犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊:犞狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊 犔狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻,犔犳 犲 狉 犿 犲 狀 狋 狌 狊 犔狆 犾 犪 狀 狋 犪 狉 狌 犿 ,犔狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻 ,犔狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻 ,犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀:犔狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻,犞狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿
5、 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊 ,犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊:犞 犻 犫 狉 犻 狅狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊;犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻;副溶血性弧菌为常见水产源食品致病菌,下可快速繁殖,引起食品污染。大量研究结果显示,国内外水产动物均存在副溶血性弧菌携带情况,携带率约为 ,夏季水温升高时,水体中固有的副溶血性弧菌大量繁殖,容易引起鱼虾蟹的爆发性死亡,造成重大 第 卷第期 总第 期 年月经济损失。与此同时,食用被副溶血性弧菌污染的食物,会引起腹痛、腹泻、发热、呕吐等多种肠胃炎症状,严重时甚至会
6、引起休克、死亡。年中国 起食物中毒事件中,由副溶血性弧菌引发 起,发病 例,占发病总人数的 ,副溶血性弧菌已成为食源性疾病头号致病菌。此外,副溶血性弧菌正逐步向北欧等国家扩展,且环境污染使其变异性和抗药性进一步加强。目前,副溶血性弧菌的防控方法主要有化学防控和生物防控,但化学药物引起的环境污染会使其变异性和抗药性进一步加强,益生菌防控因具有环境友好、生物安全等优点逐渐兴起。乳酸菌及其相关制剂因具有维持肠道菌群平衡,增强机体免疫力和抑制病原菌侵害的功能,被广泛应用于食品工业中。目前,有关饲用乳酸菌添加剂类及乳品发酵类优良乳酸菌的筛选鉴定的报道较多 ,但有关副溶血性弧菌等食品致病菌防控的乳酸菌的筛
7、选报道较少。研究将以副溶血性弧菌为指示菌,通过牛津杯抑菌法从大弹涂鱼肠道、发酵酸奶、健康母乳及婴幼儿粪便等环境中筛选乳酸菌菌株,对排除酸性产物影响后,代谢产物仍具有抑菌活性的乳酸菌分离株进行生理生化鉴定和 测序,并选取抑菌活性最高的乳酸菌分离株进行相关生物学特性评价,确保菌株具有良好的安全性与应用潜力,为后续应用于食品致病菌防控的益生菌制剂制备提供优良出发菌株。材料与方法材料样品来源样品分离自大弹涂鱼肠道、发酵酸奶、健康母乳及婴幼儿粪便。指示菌株白色念珠菌 、马红球菌 、蜡样芽 孢 杆 菌(上 海 疾 控)、莱 什 曼 氏 乳 杆 菌 、单增李斯特氏菌 、金黄色葡萄球菌 、阪崎肠杆菌 、大肠埃
8、希氏菌 、鼠伤寒沙门氏菌 、副溶血性弧菌 、荧 光 假 单 胞 菌 、哈 维 氏 弧 菌 、溶藻弧菌、嗜水气假单胞菌:浙江万里学院微生物实验室保存。主要试剂和仪器 肉汤、营养肉汤、固体培养基:青岛海博生物技术有限公司;人工胃液(,无菌)、人工小肠液(,无菌):上海源叶生物科技有限公司;戊二醛电镜固定液:泉州以达科技有限公司;细菌基因组 提取试剂盒:美国 公司;大容量全温度恒温培养振荡器:型,金坛市盛蓝仪器制造有限公司;台式冷冻离心机:型,德国赛默飞世尔科技有限公司;酶标仪:型,德国赛默飞世尔科技有限公司;仪:型,德国艾本德公司;凝胶成像系统:天能 型,上海天能科技有限公司;冷冻浓缩仪器:型,美
9、国 公司;生物扫描电镜:型,日本 公司。试验方法抑制副溶血性弧菌乳酸菌菌株的筛选取样品稀释,涂布于 平板,培养,挑选具有溶钙圈的菌株,制备种子液,以体积分数接种量接种于 液体培养基,静置发酵,、离心 ,取 上 清 液 真 空 冷 冻 干 燥,用倍 无 菌 水 复 溶,滤膜过滤,保存备用。取对数生长期的副溶血性弧菌,菌液浓度调至 ,接种 固体平板,放置牛津杯,分别加入 浓缩发酵液和 调为的浓缩发酵液,测量其抑菌圈直径。菌种鉴定()形态学鉴定:通过牛津杯试验挑选具有抑菌潜力的菌株,取单菌落革兰氏染色,在光学显微镜下观察菌体大小、形状、颜色及排列方式等。()生 理 生 化 鉴 定:挑 选 革 兰 氏
10、 阳 性 菌,参 照 对菌株进行常规生理生化试验。()分子生物学鉴定:利用基因组 提取试剂盒的方法提取菌株总,参照章检明等 的方法进行 序 列 扩 增。其 中,正 向 引 物 :,反 向 引 物 :。反应条件:预变性 ;变性 ,复性 ,延伸,次循环;延伸 。将 产物回收送至上海生物工程有限公司测序。菌株电镜表征取对数生长期的抑菌活性最高的乳酸菌分离菌株,用 磷酸缓冲液漂洗两遍,再用新鲜的戊二醛电镜固定液固定,送至南京宁标科技检测有限公司进行扫描电镜观察细菌表面特征。菌株生长产酸曲线将乳酸菌分离株以体积分数接 种 量 分 别 接 种 于 液 体 培 养 基 中,、震荡培养,每隔测量 和 值,共计
11、。以培养时间为横坐标,以 和 值为纵坐标绘制菌株生长产酸曲线。菌株人工胃肠液耐受性根据冯艳琴等 的方法,按式()、式()分别计算人工胃液和人工小肠液中菌株存活率。犛犃犃 ,(),于晨等:抑制副溶血性弧菌的乳酸菌筛选鉴定及其生物学特性研究式中:犛 人工胃液中菌株存活率,;犃 耐受人工胃液的活菌数,;犃 耐受人工胃液的活菌数,。犛犅狀犅 ,()式中:犛 人工小肠液中菌株存活率,;犅 耐受人工小肠液的活菌数,;犅狀 耐受 人 工 小 肠 液,的 活 菌 数,。菌株耐盐性参照杨小慧 的方法并修改。挑取乳酸菌分离株单菌落接种于 液体培养基中,恒温静置培养至对数期,以体积分数接种量接种于 质 量 浓 度
12、分 别 为,的 液体培养基中,静置培养,梯度稀释涂布计数,每组个平行,按式()计算耐盐率。犛犆狀犆 ,()式中:犛 菌株耐盐率,;犆 含量为的 肉汤中的活菌数,;犆狀 含量为,的 肉汤中的活菌数,。菌 株 抗 生 素 敏 感 性以 金 黄 色 葡 萄 球 菌(犛 狋 犪 狆 犺 狔 犾 狅 犮 狅 犮 犮 狌 狊犪 狌 狉 犲 狌 狊)为质控菌株,按体积分数接种量接种于 肉汤,、震荡培养;以乳酸菌分离株为试验菌株,按体积分数接种量接种于 肉汤,静置培养。将质控菌株均匀涂布于 固体平板,将试验菌株涂布于 固体平板。将不同种类的药敏片分别贴于两种平板表面,每个平板贴张抗生素药敏片,每个平板各设组平
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- 关 键 词:
- 抑制 溶血 弧菌 乳酸菌 筛选 鉴定 及其 生物学 特性 研究
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