疑似肺炎患者BALF样本应用tNGS技术进行病原学诊断的价值研究.pdf
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1、12现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.2023疑似肺炎患者 BALF 样本应用 tNGS 技术进行 病原学诊断的价值研究颜新生a,张丹a,王栋a,张李涛a,张真路a,连姝文b(武汉亚心总医院 a.检验科;b.药学部,武汉 430056)摘要:目的探究靶向高通量测序(targeted next-generation sequencing,tNGS)技术在疑似肺炎患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)样本中的病原学诊断价值。方法选取 2022 年 7 月 202
2、3 年 3 月武汉亚心总医院收治的 102 例疑似肺炎患者的 102 份 BALF 样本,对其同时进行了 tNGS 检测和传统微生物学检测,并收集患者的一般临床资料。对纳入研究的 102 例患者的 tNGS 检测结果、微生物培养结果以及其他实验室检查结果进行回顾性分析。结果tNGS 法的总体阳性检出率(93.14%)高于传统方法(58.82%),差异有统计学意义(2=32.903,P0.001);tNGS法在细菌、病毒以及混合感染方面的检出率(65.69%,55.89%,69.61%)高于传统方法(21.57%,6.86%,11.76%),差异有统计学意义(2=32.903,56.920,70
3、.708,均 P 0.001)。结论tNGS 技术在疑似肺炎患者 BALF样本中获得了较高的病原体检出率,可以有效应用于呼吸道感染性疾病的病原学诊断。关键词:靶向高通量测序;支气管肺泡灌洗液;病原体检测中图分类号:R563.1;R446.5文献标识码:A文章编号:1671-7414(2023)05-012-05doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2023.05.003Value of tNGS in the Etiological Diagnosis of BALF Samples from Suspected Pneumonia PatientsYAN Xinsheng
4、a,ZHANG Dana,WANG Donga,ZHANG Litaoa,ZHANG Zhenlua,LIAN Shuwenb(a.Department of Clinical Laboratory;b.Department of Pharmacy,Wuhan Asia General Hospital,Wuhan 430056,China)Abstract:ObjectiveTo explore the value of targeted next-generation sequencing(tNGS)in etiological diagnosis of bronchoalveolar l
5、avage fluid(BALF)samples from patients with suspected pneumonia.Methods102 samples of BALF samples from 102 suspected pneumonia patients admitted to Wuhan Asia General Hospital from July 2022 to March 2023 were selected.tNGS and traditional microbiology tests were performed on them at the same time,
6、and general clinical data of the patients were collected.tNGS test results,microbial culture results and other laboratory results of 102 patients were retrospectively analyzed.ResultsThe overall positive detection rate of tNGS method(93.14%)was higher than that of traditional method(58.82%),and the
7、difference was statistically significant(2=32.903,P 0.001).The detection rates of bacterial,viral and mixed infections by tNGS method(65.69%,55.89%,69.61%)were higher than those by traditional methods(21.57%,6.86%,11.76%),and the differences were statistically significant(2=32.903,56.920,70.708,all
8、P 0.001).ConclusiontNGS technique has a high pathogen detection rate in BALF samples of suspected pneumonia patients,and can be effectively used in the etiological diagnosis of respiratory infectious diseases.Keywords:targeted next-generation sequencing;bronchoalveolar lavage fluid;pathogen detectio
9、n感染是仅次于缺血性心脏病的全球第二大死亡原因,减少感染造成的死亡负担是全球公共卫生的紧迫优先事项1。快速准确地鉴定感染病原体是有效治疗感染的关键2。由于致病病原体种类繁多,微生物培养鉴定、涂片染色、抗原抗体检测等传统方法均存在一定的局限性,难以及时有效的对病原体进行检出。近年来,除宏基因组高通量测序(metagenomics next-generation sequencing,mNGS)技术外,新开发的靶向高通量测序(targeted next-generation sequencing,tNGS)技术也开始用于病原微生物检测。tNGS 技术是将超多重 PCR 与高通量基金项目:武汉市卫生
10、健康委员会青年项目(WX21Q29):利伐沙班血药浓度与高龄非瓣膜性房颤患者不良预后的关系研究。作者简介:颜新生(1986-),男,硕士,副主任技师,研究方向:分子诊断学,E-mail:。通讯作者:连姝文(1985-),女,本科,主管药师,研究方向:合理用药,E-mail:。测序技术相结合,对样品中的核酸进行多重 PCR 扩增,再对这些扩增产物进行高通量测序分析的检测技术。tNGS 可同时检测样本中几十至几百种常见病原微生物及其耐药基因,因此受到临床的广泛关注,但相关报道较少,诊断价值尚不十分明确。本研究旨在通过比较 tNGS 和传统方法在疑似肺炎患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveo
11、lar lavage fluid,BALF)等样本中的检出情况来评估 tNGS 技术在肺炎病原学诊断中的价值,以期为 tNGS 技术的临床应用提供参考。1材料与方法 13现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.20231.1研究对象选取 2022 年 7 月 2023 年 3 月武汉亚心总医院收治的 102 例疑似肺炎并行支气管镜检查的患者为研究对象,其中男性 59 例,女性 43例;中位年龄 58(34,71)岁。纳入标准:因疑似肺炎住院;入院后行支气管镜收集 BALF 样本送 tNGS 检测并同时送微生物培养检
12、测;有其他相关样品可按标准程序进行常规病原学检测;受试者及其家属知情同意。排除标准:样本污染或不合格;受试者临床资料不完善。本研究为回顾性分析研究,研究符合医学伦理学标准。1.2仪器与试剂核酸提取试剂盒(美基生物,货号 R6672B-F);呼吸道病原微生物多重联合检测试剂盒(金圻睿公司,货号 KS608-100HXD96);哥伦比亚血琼脂培养基(广州迪景,货号 LS0109);曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒(丹娜生物,货号DNK-1402-2);甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒(广州万孚);嗜肺军团菌抗体检测试剂盒,腺病毒抗体检测试剂盒,呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒,肺炎支原体抗体检测试剂盒,肺炎
13、衣原体抗体检测试剂盒(安图生物);结核分支杆菌 rpoB 基因和突变检测试剂盒(塞沛公司,货号GXMTB/RIF-CN-50);自动化核酸提取仪(济凡生物,型号 PuriferHT);PCR 仪(苏州东胜,型号 ETC811plus);二代测序仪(金圻睿公司,型号MiniSeqDx-CN);VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定及药敏分析系统,VUTEK MS 微生物质谱检测系统(生物梅里埃);A2000 Plus 化学发光分析仪(安图生物);IFlash 3000 化学发光分析仪(亚辉龙);HB-100E 酶联免疫分析仪(丹娜生物)。1.3方法 1.3.1标本采集及临床资料收集:所
14、有患者行支气管镜检查并收集 BALF 样本,将 BALF 样本同时送检微生物培养和 tNGS 检测;通过病案管理系统查询患者同时期送检的其他样本病原学检测结果并记录。1.3.2tNGS 检测:取疑似肺炎患者其中一份 BALF样本送金域医学进行呼吸道 153 种病原体检测。将BALF 样本彻底混匀后,取 1 300l 在 12 000r/min条件下离心 5min,弃 600l 上清;用移液器混匀底部体系,取 400l 使用磁珠法抽提试剂盒提取总核酸(DNA+RNA);采用超多重 PCR 技术,对目标序列进行靶向扩增富集,形成无需打断的短片段核酸;产物纯化后加入接头,进行第二轮 PCR 扩增构建
15、文库,并使用超微量分光光度计进行文库质控后上机测序;测序完成后经过数据分析最终形成报告。本研究中tNGS 检测范围包括65种细菌、68种病毒、3 种支原体、3 种衣原体和 14 种真菌,见表 1。表 1 tNGS 检测 153 种病原体名称及分类类别病原体革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、惠普尔养障体、蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、假结核棒状杆菌、白喉棒状杆菌、化脓隐秘杆菌、马红球菌、结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、嗜血分枝
16、杆菌、戈登分枝杆菌、蟾分枝杆菌、母牛分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、星形诺卡菌、巴西诺卡菌、凹陷诺卡菌、盖尔森基兴诺卡菌革兰阴性菌脑膜炎奈瑟菌、大肠埃希菌、肠道沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、产气克雷伯菌、阴沟肠杆菌、黏质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、卡他莫拉菌、脑膜脓毒性伊丽莎白菌、流感嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌、多杀巴斯德菌、土拉弗朗西斯菌、百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌、鸟鲍特菌、霍氏鲍特菌、嗜肺军团菌、脆弱拟杆菌立克次体属伤寒立克次体、普氏立克次氏体、立氏立克次体、恙虫东方体、贝纳柯克斯体DNA
17、病毒人类博卡病毒 1 型、人类博卡病毒 2 型、人类博卡病毒 3 型、人类博卡病毒 4 型、人类细小病毒 B19、人类腺病毒、人类腺病毒 B 组、人类腺病毒B3型、人类腺病毒B7型、人类腺病毒B55型、人类腺病毒C组、人类腺病毒C1型、人类腺病毒C2型、人类腺病毒C5型、人类腺病毒 E 组、人类腺病毒 E4 型、人类疱疹病毒 1 型、人类疱疹病毒 2 型、人类疱疹病毒 3 型、人类疱疹病毒 4 型、人类疱疹病毒 5 型、人类疱疹病毒 6 型、人类疱疹病毒 7 型、BK 多瘤病毒、JC 多瘤病毒RNA 病毒甲型流感病毒、甲型流感病毒 H1N12009、甲型流感病毒 H1N1、甲型流感病毒 H3N
18、2、甲型流感病毒 H5N1、甲型流感病毒 H7N9、乙型流感病毒、丙型流感病毒、人类偏肺病毒、人类冠状病毒 229E、人类冠状病毒 HKU1、人类冠状病毒 NL63、人类冠状病毒OC43、腮腺炎病毒、人副流感病毒 1 型、人副流感病毒 2 型、人副流感病毒 3 型、人副流感病毒 4 型、人呼吸道合胞病毒 A 型、人呼吸道合胞病毒 B 型、风疹病毒、麻疹病毒、肠道病毒、肠道病毒 A 组、柯萨奇病毒 A2 型、柯萨奇病毒 A6 型、柯萨奇病毒 A16 型、肠道病毒 71 型、肠道病毒 B 组、柯萨奇病毒 A9 型、柯萨奇病毒 B2 型、柯萨奇病毒 B3 型、柯萨奇病毒 B5 型、柯萨奇病毒 B6
19、型、埃可病毒、肠道病毒 C 组、肠道病毒 D 组、肠道病毒 D68 型、鼻病毒、鼻病毒 A 型、鼻病毒 B 型、鼻病毒 C 型、轮状病毒支原体肺炎支原体、细小脲原体、解脲支原体衣原体肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体真菌白色念珠菌、新生隐球菌、格特隐球菌、荚膜组织胞浆菌、马尔尼菲篮状菌、烟曲霉、伞枝横梗霉、米根霉、小孢根霉、微小根毛霉、尖端赛多孢子菌、裂褶菌、阿萨希丝孢酵母、耶氏肺孢子菌14现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.20231.3.3传统方法检测:传统检测包括细菌培养鉴定、真菌培养鉴定、涂片革兰染色
20、、涂片抗酸染色、甲乙型流感病毒抗原检测、呼吸道 7 项抗体检测、血清半乳甘露聚糖检测(GM 试验)和结核分枝杆菌基因检测(Gene Xpert)。其中呼吸道 7 项抗体检测包含甲乙型流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、嗜肺军团菌和腺病毒抗体检测。取疑似肺炎患者其中一份 BALF 样本进行常规微生物培养、涂片染色和 Gene Xpert 检测,取患者静脉血样本进行 GM 试验和抗体检测,取患者咽拭子样本进行甲乙型流感病毒抗原检测。阳性判断标准参照各厂家试剂盒说明。1.4统计学分析采用 SPSS 21.0 软件作为数据统计分析工具。Kolmogorov-Smironv 法对数据进行正
21、态性检验,非正态分布计量资料以中位数(四分位区间)M(P25,P75)表示;计数资料以 n(%)表示,组间阳性率比较采用卡方检验。P 0.05 为差异有统计学意义。2结果 2.1tNGS 与传统方法检出的病原体分布情况见表 2。在 102 份样本中,tNGS 共检出 37 种 245 株病原微生物,其中细菌 103 株(42.04%)、病毒 80 株(32.65%)、真菌 33 株(13.47%)、分枝杆菌 14 株(5.71%)、肺炎支原体 12 株(4.90%)、鹦鹉热衣原体 3 株(1.22%)。微生物培养共检出 18 种 42 株病原体,其中细菌27株(64.29%)、真菌15株(35
22、.71%)。本研究传统方法检测包括 BALF 样本的微生物培养结果和其他传统方法检测结果两部分。除培养法外,其他传统方法还检出肺炎支原体抗体阳性 7 例、甲型流感病毒抗原阳性 7 例、GM 试验阳性 7 例、涂片抗酸染色阳性 7 例和 Gene Xpert 阳性 4 例,共计 32 例。2.2tNGS 与传统方法检测结果比较对 102 例患者 tNGS 检测结果与微生物培养结果联合其他传统方法检测的结果进行比较,存在以下三种情况:双阴性 7 例(6.86%);单阳性 35 例(34.31%),表示 tNGS 检测结果阳性,而传统法检测结果阴性;双阳性 60 例(58.82%),其中双阳性具体分
23、为以下三种情况:a两种方法结果完全符合(47.6%);b两种方法结果部分符合(42.9%),即两种方法检出的病原体至少有一种是相同的;c两种方法结果完全不符合(9.5%)。在 102 例患者中,tNGS 检出阳性 95 例(93.14%),高于传统方法检出的 60例(58.82%),差异有统计学意义(2=32.903,P 0.001)。在混合感染检测方面,tNGS 检出 71例(69.61%),高于传统方法检出的12例(11.76%),差异有统计学意义(2=70.708,P 0.001)。两种方法的病原体分类检出情况比较见表 3。tNGS 在细菌、病毒方面的检出率高于传统方法,差异有统计学意义
24、(均 P 0.001);两者在真菌、支原体和结核分枝杆菌中的检出率比较,差异无统计学意义(均 P 0.05)。表 2 tNGS 与培养法检测的病原体分布情况 n(%)病原体tNGS(n=245)培养法(n=42)细菌肺炎克雷伯菌18(7.35)5(11.90)流感嗜血杆菌12(4.90)0(0.00)铜绿假单胞菌10(4.08)7(16.67)屎肠球菌10(4.08)1(2.38)金黄色葡萄球菌9(3.67)1(2.38)鲍曼不动杆菌8(3.27)2(4.76)嗜麦芽窄食单胞菌8(3.27)3(7.14)溶血嗜血杆菌5(2.04)0(0.00)肺炎链球菌5(2.04)0(0.00)粪肠球菌4(
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