香蕉皮蛋白质的制备及其组成分析.pdf
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1、6月出版51工程食品基础研究2023年第2 期香蕉皮蛋白质的制备及其组成分析祝琼*朱西平*张琦谢丹李玉锋(安徽工程大学生物与食品工程学院,安徽芜湖241000)摘要要采用碱溶酸沉法提取香蕉皮粗蛋白,通过单因素试验考察液料比、提取液pH值、超声时间和提取温度4个因素对粗蛋白提取率的影响,在此基础上利用响应面法对提取条件进行优化。结果表明,香蕉皮粗蛋白最佳提取条件为:液料比5.5:1(mL/g),提取液pH值11.50,超声时间10 2 min,提取温度42,粗蛋白实际提取率为(52.2 7 1.35)%,相对误差为2.2 6%。香蕉皮粗蛋白纯度为(2 8.7 50.0 4)%,主要分子量为18
2、kDa23kDa,氨基酸种类和含量与香蕉果肉极为相似,具有抗氧化能力。关键词香蕉皮;粗蛋白;碱溶酸沉;响应面;组成分析Preparation andofbananapeelproteinanaSISZHU QiongZHU XipingZHANGQiXIEDanLI Yufeng*(School of Biological and Food Engineering,Anhui Polytechnic University,Anhui Wuhu241000,China)Abstract The crude protein from banana peel was extracted by Alk
3、ali Solubilization and Acid Precipitation Method.The rate of crude protein from banana peel was studied by following single factor experiment:the ratio of liquid tomaterial,the pH of extraction solution,the ultrasonic time and extraction temperature.On the basis of this,responsesurface methodology(R
4、SM)was used to optimize the extraction conditions.The experimental results showed that theoptimum conditions for the extraction of banana peel protein were 5.5:1 ratio of liquid to material,11.50 pH ofextraction solution,ultrasonic time of 102 min,and extraction temperature of 42C.A t t h i s t i me
5、,t h e e x t r a c t i o n r a t e o fcrude prorein of banana peel was(52.27 1.35)%,and the relative error was 2.26%.The purity of banana peel crudeprotein was(28.75 0.04)%,and the main molecular weight was between 18 and 23 KDa.The kinds and contents ofamino acids in banana peel crude protein were
6、very similar to those in banana pulp,and it had antioxidant ability.Keywords banana peel;crude protein;alkali solution and acid precipitation method;response surface methodology;composition analysis中图分类号:TS255.3文献标识码:A文章编号:16 7 3-6 0 44(2 0 2 3)0 2-0 0 51-0 7D0I:10.3969/j.issn.1673-6044.2023.02.016香
7、蕉是热带和亚热带地区广泛种植和食用的水果作物,人均消费量为12 kg,是世界上仅次于水稻、小麦和玉米的主要粮食作物。香蕉皮是香蕉的表皮,整个香蕉果实中,香蕉皮占比在30%左右。目前,香蕉皮的利用率低且用途少,常作为有机肥料和动物饲料使用。但随着香蕉加工业的发展壮大,每年大约产生36 0 0 万吨香蕉皮,而大量香蕉皮通常未经任何处理就被倾倒到环境中,不仅会造成环境污染而且浪费资源。香蕉皮中含有多糖、多*基金项目:国家自然科学基金(No.32202046);安徽省自然科学基金(No.2108085QC142);安徽工程大学引进人才科研启动金(No.2020YQQ049)。*祝琼,女,2 0 0 0
8、 年出生,安徽工程大学食品科学与工程专业硕士研究生在读。*朱西平,通讯作者,E-.收稿日期:2 0 2 3-0 2-12酚、有机酸、蛋白质、油脂、维生素等多种营养物质,具有抗肿瘤、治疗脚气、防治高血压及脑溢血等功能,极具开发价值。当前食品界对香蕉皮蛋白提取及其应用研究的内容较少,故香蕉皮方面的研究有很大的探索空间。目前,香蕉皮蛋白的提取方法有三氯乙酸-丙酮沉淀法、碱溶酸沉法、丙酮沉淀法。其中三氯乙酸-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法对所需试剂和设备要求较高,提取成本高且产率低,不适合工业上进行大规模的蛋白制备,而碱溶酸沉法所需设备简单且便于操作,与其他两种方法相比更适用于香蕉蛋白提取的工业化生产。本文采
9、用碱溶酸沉法提取香蕉皮中的粗蛋白,对液料比、提取液pH值、超声时间、提取温度4个因素的影响作用进行了探索,通过响应面试验优化了香蕉皮粗蛋白的提取工艺条件,并利用凯氏定氮法、葱酮-硫酸法、SDS-PAGE等方法对其粗蛋白-XTUU/O0uH6月出版52食品工程基础研究2023年第2 期组成及其性质进行测定,为香蕉皮中蛋白质提取和其蛋白的利用提供了依据,为进一步充分利用香蕉皮资源,提高香蕉的综合利用价值提供了一定的理论参考。1材料与方法1.1材料与试剂香蕉,市售。香焦,市。盐酸、氢氧化钠、硫酸、五水硫酸铜、硫酸钾、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、乙醇、酒石酸钾钠、酪蛋白、无水葡萄糖、硫脲、甲醇
10、、乙酸,均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司;过硫酸钾、葱酮、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(A BT S),均为分析纯,购于上海阿拉丁试剂有限公司;ProteinMarker(G 2 0 58)、SD S-PA G E 凝胶制备试剂盒(50 T)、SD S-PA C E 蛋白上样缓冲液(G 2 0 13),购于武汉赛维尔生物科技有限公司。1.2仪器与设备JY1002分析天平,上海精密科学仪器有限公司;FY-KDS-AS凯氏定氮仪,杭州菲跃仪器有限公司;SZ-500A-3粉碎机,永康市善竹贸易有限公司;KM-410B超声波清洗仪,广州市科洁盟仪器有限公司;S
11、HZ-D循环水式多用真空泵,上海互佳仪器有限公司;TDL5M台式低速冷冻离心机,盐城市凯特实验仪器有限公司;LGJ-12真空冷冻干燥机,北京松源华兴科技有限公司;UV-5200紫外可见分光光度计,上海元析仪器设备有限公司;pHS-2FpH计,上海雷磁有限公司;DF-101S磁力搅拌器,上海力辰邦西仪器有限公司。1.3试验方法1.3.1香蕉皮粗蛋白提取1.3.1.1香蕉皮预处理将新鲜的香蕉皮置于烘箱内烘干,用粉碎机粉碎,储存备用。1.3.1.2提取工艺采用碱溶酸沉法从香蕉皮中提取香蕉皮粗蛋白。称取2 0.0 0 g香蕉皮研磨粉于锥形瓶中,加人一定量的蒸馏水,混匀后调节溶液的pH值,超声(功率2
12、40 W,频率40 Hz)浸提后,40 0 0 r/min离心30 min,取上清液再次抽滤后收集液体,并调pH值至香蕉皮蛋白质等电点,待蛋白质凝沉后离心(40 0 0 r/m i n,30 m i n),取沉淀弃去上清液,经冷冻干燥得到香蕉皮粗蛋白。1.3.1.3香蕉皮蛋白质等电点测定经过多次试验,确定香蕉皮蛋白质等电点在1.503.00之间。取香蕉皮研磨粉10 0 g,按照液料比5.0:1(mL/g)加入超纯水,均质后调节溶液pH值到11.0 0,恒温40 超声9 0 min(功率2 40 W,频率40 Hz)后,40 0 0 r/min离心30 min,取上清液再次抽滤后收集液体。把上清
13、液分为8 等份装于10 0 mL烧杯中,将pH值分别调为1.6 0、1.8 0、2.0 0、2.2 0、2.40、2.6 0、2.8 0、3.0 0,搅拌均匀后离心(40 0 0 r/min,30min),收集沉淀并保留上清液。以酪蛋白为标准物质,采用双缩脲-分光光度法测定上清液蛋白质含量。其中,上清液蛋白质含量最少所对应的pH值最接近香蕉皮蛋白质的等电点。1.3.1.4蛋白质含量测定本试验采用GB5009.5一2 0 10食品安全国家标准食品中蛋白质的测定中的凯氏定氮法测定1.3.1.5香蕉皮粗蛋白提取率的测定粗蛋白蛋白含量粗蛋白提取量定拍香蕉皮蛋白含香蕉皮质量1.3.2单因素试验方法1.3
14、.2.1液料比对香蕉皮粗蛋白提取率的影响参照1.3.1.2 进行操作,固定提取液pH值11.00、超声时间6 0 min、提取温度30,探索不同液料比2.5:1、5:1、7.5:1、15:1、2 0:1(mL/g)对香蕉皮蛋白提取率的影响。1.3.2.2提取液pH值对香蕉皮粗蛋白提取率的影响参照1.3.1.2 进行操作,固定液料比5:1(mL/g)、超声时间6 0 min、提取温度30,探索不同pH值9.00、10.0 0、11.0 0、12.0 0、13.0 0 对香蕉皮蛋白提取率的影响。1.3.2.3超声时间对香蕉皮粗蛋白提取率的影响参照1.3.1.2 进行操作,固定液料比5:1(mL/g
15、)、提取液pH值11.0 0、提取温度30,探索不同超声时间30 min、6 0 m i n、9 0 m i n、12 0 m i n、150 m i n 对香蕉皮蛋白提取率的影响。1.3.2.4提取温度对香蕉皮粗蛋白提取率的影响参照1.3.1.2 进行操作,固定液料比5:1(mL/g)、提取液pH值11.0 0、超声时间6 0 min,探索不同提取温度30、40、50、6 0、7 0 对香蕉皮蛋白提取率的影响1.3.3响应面优化试验在单因素试验结果的基础上,以Box-Behnken响应面模型设计试验,选取液料比、提取液pH值、超声时间和提取温度4个影响因素为自变量,以香蕉皮蛋白提取率为响应值
16、,进行响应面试验分析,采用Design-Expert10统计分析软件建立Box-Behnken模型,优化香蕉皮蛋白提取工艺参数,试验因素与水平设计见下页表1。1.3.4香蕉皮粗蛋白组成测定1.3.4.1SDS-PAGE测定为了研究香蕉皮粗蛋白的构成及其蛋白质量浓度对电泳的影响,分别设置质量浓度为1.0 0、2.0 0、6月出版53工程食品基础研究2023年第2 期3.00、4.0 0、5.0 0、6.0 0、8.0 0、10.0 0、12.0 0、15.00、2 0.0 0(mg/mL)的香蕉皮粗蛋白进行SDS-PAGE分析。表1响应面试验因素与水平设计因素水平A液料比C超声时间D提取温度B提
17、取液pH值mL/gmin-12.510.00603005.011.00904017.512.0012050根据目的蛋白分子量和所选电泳缓冲液不同,选择合适浓度的SDS-PAG下层胶。按照表2 配制分离胶(浓度为12%);按照表3,配制浓缩胶(浓度为5%)。表2分离胶浓度配制表水30%丙烯1.5M tris-HCl110%SDS10%APTEMEDmL酰胺/mLmLmL从L1.982.401.5060.0060.003.00表3浓缩胶浓度配制表水30%丙烯1.0M tris-HCl 10%AP10%SDSTEMEDmL酰胺/mLmLLL2.950.750.7545.0060.006.00电泳条件
18、:使用TGT快速电泳缓冲液G2081进行电泳:2 0 0 V250V恒压,2 5min30min可完成电泳;使用Tris-Glycine电泳缓冲液进行电泳,上层胶设置电压9 0 V,电泳约6 0 min,下层胶调整电压为12 0 V,约6 0 min90min。染色与洗脱:电泳之后的胶放人染色液中震荡培养箱(37)中10 0 r/min震荡染色9 0 min。将洗脱液加人充分染色的胶中,置于震荡培养箱中(37)中进行洗脱(10 0 r/min),每2 0 min更换一次洗脱液,洗脱2 4次,成像。1.3.4.2氨基酸组成测定参照GB5009.1242016食品安全国家标准食品中氨基酸的测定进行
19、试验。1.3.4.3抗氧化活性测定根据孟想等的方法分析样品的ABTS阳离子自由基清除能力。首先对粗蛋白样品进行溶解稀释,将样品分别配制成质量浓度0.40 mg/mL、0.8 0 m g/m L、1.20mg/mL、1.6 0 m g/m L、2.0 0 m g/m L 的溶液,然后制备ABTS工作液。ABTS工作液使用前用8 0%甲醇溶液稀释,使其在7 34nm外的吸光值为(0.7 0.0 2)。取0.2 0 mL样品提取液于试管中,加人3.8 0 mLABTS工作液,避光反应30 min,并在734nm处测定吸光值。以Trolox质量浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线,结果以Trolo
20、x当量计(mgTroloxt/g)。2结果与分析2.1香蕉皮蛋白等电点测定根据双缩脲法测定的酪蛋白标准曲线见图1。0.80r0.600.400.200.002.004.006.008.0010.00酪蛋白质量浓度/mgmL-i图1酪蛋白含量标准曲线由图1可知,在酪蛋白质量浓度为0.0 0 mg/mL10.00mg/mL的范围内线性良好,相关系数为R=0.9987,方程为Y=0.0599X+0.0839。香蕉皮蛋白质等电点测定结果如图2 所示6.004.002.000.002.00 2.202.40 2.602.803.00酸沉pH值图2香蕉皮蛋白质等电点的测定结果由图2 可知,pH值在1.6
21、0 到2.40 时,上清液中蛋白质含量呈下降趋势,在pH值2.40 时达到最低值,然后又呈上升趋势。因此,香蕉皮蛋白质的等电点为2.40。2.2单因素试验结果2.2.1液料比对香蕉皮粗蛋白提取率的影响液料比对香蕉皮粗蛋白提取率的影响结果如图3所示。45.00a40.00b/率35.00Cd30.00Td25.0020.0012.5:15:117.5:115:120:1液料比/mgmL-1图3液料比对蛋白质提取率的影响由图3可知,液料比在5:1之前,香蕉皮粗蛋白提取率逐步增大,当液料比达到5:1后,随着液料比的不断提高,粗蛋白提取率开始下降。综合考6月出版54基础研究食品工程2023年第2 期虑
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