响应面法优化2种混合绿藻的培养基.pdf
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1、4期1263响应面法优化2种混合绿藻的培养基王其鹏,张树林,张达娟*,李淼淼,王鑫鑫(天津市水产生态及养殖重点实验室/天津农学院水产学院,天津300384)摘要:【目的】优化普通小球藻(Chlorella vulgaris)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)2种混合绿藻的培养基,为提高混合绿藻的生长速度及推广应用淡水有益藻类混合培养技术提供参考依据。【方法】采用单因素试验筛选BG11培养基中适宜普通小球藻和斜生栅藻2种混合绿藻增殖的营养盐浓度范围,通过Plackett-Burman试验筛选显著影响混合绿藻生长的营养因素,采用响应面法优化主要营养盐的最佳浓度,并进行混合绿藻培
2、养验证试验。【结果】通过单因素试验筛选出相对适宜混合绿藻生长的7种营养盐浓度范围,通过Plackett-Burman试验筛选出显著影响混合绿藻生长的3个营养因素(分别为Na2CO3、K2HPO4和NaNO3)。响应面法分析结果表明,营养因素中NaNO3与K2HPO4交互作用强,对混合绿藻细胞密度具有显著影响(P0.05,下同),得到优化后的培养基配方为NaNO31600.00 mg/L、K2HPO450.85 mg/L和Na2CO332.39 mg/L。使用优化后的培养基培养混合绿藻,可显著提高其细胞光合系统PSII最大光能转换效率,混合藻细胞密度最高达36.75106个/mL,较对照组显著提
3、高24.28%,在整个培养周期内,普通小球藻和斜生栅藻的细胞密度比基本为1.00 1.00。【结论】通过响应面法优化的普通小球藻和斜生栅藻混合绿藻培养基,能实现混合绿藻的高密度培养,可供大规模推广应用淡水有益藻类混合培养技术时参考;培养2种混合绿藻培养基中的Na2CO3、K2HPO4和NaNO3最佳浓度分别为32.39、50.85和1600.00 mg/L。关键词:普通小球藻;斜生栅藻;混合绿藻;响应面法;培养基中图分类号:S917文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)04-1263-10收稿日期:2023-02-16基金项目:天津市科技计划项目(22ZYCGSN00260);
4、天津市教委科研计划项目(2020ZD06,2021KJ110);天津市淡水养殖产业技术体系创新团队养殖水环境调控岗位项目(ITTFRS2021000-009)通讯作者:张达娟(1981-),https:/orcid.org/0000-0001-5854-2900,博士,主要从事养殖水质调控及水域生态学研究工作,E-mail:第一作者:王其鹏(1999-),https:/orcid.org/0000-0002-5433-5506,研究方向为养殖水环境调控与修复,E-mail:Optimization of culture medium for two mixed green algae byre
5、sponse surface methodologyWANG Qi-peng,ZHANG Shu-lin,ZHANG Da-juan*,LI Miao-miao,WANG Xin-xin(Tianjin Key Laboratory ofAqua-ecology andAquaculture/College of Fisheries,TianjinAgricultural University,Tianjin 300384,China)Abstract:【Objective】This study optimized the culture medium for Chlorella vulgar
6、is and Scenedesmus obliquus,which provided reference for improving the growth rate of mixed greenalgae and promoting the application of mixedculture technology of freshwater beneficial algae.【Method】The concentration ranges of nutrient salt that suitable for theproliferation of C.vulgaris and S.obli
7、quus in BG11 medium were screened by single factor test.And the nutrient factorsthat significantly affected the growth of the mixed green algae were determined by Plackett-Burman test.By using responsesurface methodology,the optimal concentrations of the main nutrient salts in BG11 medium were optim
8、ized.Then,con-firmatory experiment of the mixed green algae culture was performed.【Result】Relatively suitable concentrations of 7nutrient salts for the mixed green algae growth were determined by single factor test.Using the Plackett-Burman test,3 nutrient factors,Na2CO3,K2HPO4and NaNO3,which signif
9、icantly impacted the growth of mixed green algae most weredetermined via Plackett-Burman test.The results of response surface methodology analysis showed that the strong interac-tion between NaNO3and K2HPO4had a significant effect on the cell density of mixed green algae(P0.05,the samebelow).In the
10、optimized medium,NaNO3,K2HPO4and Na2CO3were 1600.00,50.85 and 32.39 mg/L,respectively.Maxi-mum light conversion efficiency in the photosynthesis PSII system of the mixed green algae in the optimized medium wassignificantly improved.The cell density of mixed green algae in the optimized medium group
11、peaked at 36.75106cells/mL,which was significantly increased by 24.28%than the control group.Furthermore,the cell density rate of C.vulgaris and南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(4):1263-1272ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.04.03154卷南 方 农 业 学 报 12640引言【研究意
12、义】微藻是水生态系统中重要的初级生产者,通过吸收水中的氮、磷、重金属和有机物等污染物从而净化水质(陈晓江等,2022)。已有研究发现,利用有益藻类可提高共生藻的优势和藻类多样性,从而改变水体浮游植物群落结构(Qiu et al.,2019;宋婵媛等,2022)。绿藻属于有益藻类,既可作为水产动物的饵料,也可在水体中抑制有害藻类生长,维持生态系统稳定(Bittencourt-Oliveira et al.,2015)。绿 藻 门 的 小 球 藻(Chlorella)和 栅 藻(Scenedesmus)已广泛应用于水产养殖、食品加工、环保行业、医药保健和生物能源等领域(Mujtabaand Lee
13、,2017;王小冬等,2022),因此,其规模化培养需求也不断扩大。但目前藻类培养存在细胞密度小、培养效率较低及培养基不适应大规模培养等问题。因此,探究一种能高效、大规模培养小球藻和栅藻的培养基,并规模化混合培养2种绿藻,对提高混合藻类生长速度及在水产养殖领域推广应用淡水有益藻类混合培养技术具有重要意义。【前人研究进展】已有研究发现,适合淡水小球藻生长的最佳碳源为葡萄糖(葛珍珍等,2012),其最适浓度为50.00 g/L(李金穗等,2012),但在海洋小球藻的培养基中添加葡萄糖却降低油脂产率,而以NaNO3为氮源时生物量产率和油脂产率均最大(高影影,2013)。在C6H12O6和NH4Cl最
14、适浓度分别为1500.00和300.00mg/L的培养基中,斜生栅藻(S.obliquus)的生长率与培养基初始氮浓度和氮磷比(N/P)密切相关,当氮浓度为247.00 mg/L、N/P=25 1时生长最好(宋志伟等,2015;罗晓霞等,2018;谢静等,2021)。Priyanka等(2020)以NaNO3为氮源,NaH2PO4为磷源优化特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)培养基,可有效提高特氏杜氏藻中的玉米黄质含量。螺旋藻(Spirulina)在纯碱生产废料17.00 g、NaNO32.00 g、KCl 1.00 g、KH2PO41.60 g条件下培养,其藻蓝蛋白含量
15、最高(谢丽丹和王素英,2017)。已有研究结果显示,氮缺乏会抑制铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的分裂增殖和正常代谢过程,但这种抑制作用随着氮缺乏时间的延长而减弱(张达娟等,2019)。谢静等(2021)研究认为,N/P=5 1适宜铜绿微囊藻生长,当氮浓度相同时,N/P对其最大生物量具有显著影响。可见,不同藻类的生长与营养盐种类和浓度密切相关,但培养基成分种类繁多,各研究结果中影响藻类生长的关键营养盐存在一定差异,因此,优化藻类的培养基组成尤为重要。常用的藻类培养基优化方法有单因素试验、正交设计、均匀设计、二次回归正交旋转组合、遗传算法和响应面优化设计法等,其中,单因
16、素法仅考虑一种因素的影响,缺乏因素间的交互作用,正交试验法虽能同时考虑多种因素,但不能得出因素和响应值间明确的函数表达式(回归方程),进而无法求得整个区域中因素的最佳组合和最优值(杨琪等,2012;韩谦等,2018)。响应面分析法是根据多元二次回归方程对各影响因素和响应值间的函数关系进行拟合,从而对选取条件和所得结果进行全面分析寻求最优工艺参数的方法,已在多个领域广泛应用(杨晶晶和端允,2018)。【本研究切入点】目前,应用响应面法优化混合藻类培养基的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】选择由普通小球藻(C.vulgaris)和斜生栅藻组成的混合藻类,通过响应面分析法确定其同时存活的营养盐最佳浓
17、度,了解培养基中影响绿藻生长的关键因素,为提高混合藻类生长速度和生物量及推广应用淡水有益藻类混合培养技术提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料试验于2022年68月在天津市水产生态及养殖重点实验室进行。普通小球藻和斜生栅藻藻种购自上海光语生物科技有限公司,使用BG11培养基于光照培养箱(日本三洋有限公司MLR352-PC)中培养,随后人工混合,形成混合藻,经多次筛选与长期培养,稳定二者密度比为1 1,培养温度为251,S.obliquus was basically 1.00 1.00 throughout the culture cycle.【Conclusion】The mixed gr
18、een algae culture medium ofC.vulgaris and S.obliquus optimized by response surface methodology can realize the high density culture of mixed greenalgae,which can be used as a reference for the large scale application of mixed culture technology of freshwater benefi-cial algae;the optimal concentrati
19、ons of Na2CO3,K2HPO4and NaNO3in the culture medium of two mixed green algaeare 32.39,50.85 and 1600.00 mg/L respectively.Key words:Chlorella vulgaris;Scenedesmus obliquus;mixed green algae;response surfaceme thodology;culturemediumFoundation items:Tianjin Science and Technology Planning Project(22ZY
20、CGSN00260);Tianjin Education Com-mission Research Project(2020ZD06,2021KJ110);Tianjin FreshwaterAquaculture Industry Technology System Innova-tion Team-Aquaculture Water Environment Regulation Post Project(ITTFRS2021000-009)4期1265光照强度为90.00 mol/(m2s),光暗比为12 h 12 h,每天摇瓶3次,防止沉淀。1.2试验方法1.2.1营养盐单因素试验以BG
21、11培养基为基础培养基,进行7种营养盐单因素(分别将C6H8FeNO7、K2HPO4、Na2CO3、MgSO4、C6H8O7、NaNO3和CaCl2设为因素A、B、C、D、E、F和G)试验,每种营养盐均设1个对照(CK,培养基中不添加营养盐)和5个浓度处理组(表1),每组设3个平行。取对数生长期的混合绿藻离心(5000 r/min,5 min,4),去上清液,取藻泥添加至相应的培养基中,藻细胞初始密度均为1106个/mL(密度比为1 1),培养6 d时使用血球计数板计数每组的藻细胞,获得7种营养盐的最适浓度范围。1.2.2响应面优化培养基试验Plackett-Burman(P-B)试验:根据单
22、因素试验结果,利用Minitab 19.0设计进行12次P-B试验,每个因素设2个水平,其中高水平为低水平的2倍,每组设3个平行,测定培养6 d时的藻细胞密度,以此为响应值,筛选对混合绿藻生长最显著的营养盐因子。Box-Behnken(B-B)试验:以P-B试验为基础,选取影响显著的营养盐因子,每个因子取3个水平,以(+1,0,-1)编码,进行B-B试验(王立原,2018),测取培养6 d时的藻细胞密度为响应值,采用响应面软件Design-Expert 8.0的响应面分析法优化试验,每组设3个平行,共设17个试验点(中心点重复5次,用于估计试验误差),以获得显著因素的0最佳浓度水平。通过Des
23、ign-Expert 8.0对数据进一步拟合分析,得到关键营养盐的最适浓度。1.2.3验证试验分别以优化后的培养基(优化组)和原BG11培养基(对照组)培养混合绿藻,开展混合绿藻生长验证试验,每组设3个平行,共培养14 d,每隔1 d使用血球计数板与叶绿素荧光仪(Phyto-PAM)测定混合绿藻的藻细胞密度与最大光能转换效率(Fv/Fm)。1.3统计分析试验数据采用SPSS 26.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA),以Duncan s新复极差法进行组间多重比较,以独立样本t检验对验证试验中藻细胞密度进行统计分析,以Origin 2021绘制柱状和折线图;采用Design-Exp
24、ert 8.0绘制等高线和响应曲面图,并对响应值藻细胞密度进行回归拟合和方差分析。2结果与分析2.1营养盐单因素试验结果从图1-A可看出,NaNO3浓度为1500.00 mg/L时斜生栅藻的细胞密度均显著(P0.05,下同)或极显著(P0.05,下同),普通小球藻和斜生栅藻的细胞密度比趋于1.00 1.00,而CK中斜生栅藻的生长受到显著抑制,说明适合混合藻生长的最佳NaNO3浓度为1500.00mg/L;从图1-B和图1-C可看出,K2HPO4和Na2CO3浓度分别为50.00和20.00 mg/L时,2种混合绿藻的总细胞密度最高,此后随着K2HPO4浓度的升高,普通小球藻的细胞密度比降低,
25、斜生栅藻的细胞密度比升高,而随着Na2CO3浓度的升高,2种混合藻细胞的密度比从普通小球藻较高转变为二者趋于1.00 1.00,说明适当的磷源和碳源可较好地促进斜生栅藻生长;从图1-D可看出,MgSO4浓度为75.00 mg/L时,2种混合绿藻的总细胞密度最高,此后随着MgSO4浓度升高普通小球藻的细胞密度比升高,斜生栅藻细胞密度比降低,说明适宜的MgSO4浓度可较好地促进普通小球藻生长;从图1-E和图1-F可看出,C6H8O7和C6H8FeNO7浓度为6.00 mg/L时,2种混合绿藻的总细胞密度最高,其他各浓度处理组普通小球藻与斜生栅藻的细胞密度比基本接近1.00 1.00,说明C6H8O
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