糖尿病性心肌病小鼠心肌线粒体circRNA表达谱与功能富集分析.pdf
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1、第 卷第期年月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)J o u r n a l o fX ia nJ i a o t o ngU n i v e r s i ty(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l N o S ep 本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版基础研究糖尿病性心肌病小鼠心肌线粒体c i r c R N A表达谱与功能富集分析王毅,尤红俊,韩稳琦,刁佳宇(陕西省人民医院心内二科,陕西西安 )摘要:目的探索糖尿病性心肌病(d i a b e t i cc a r d i
2、o m y o p a t h y,D CM)小鼠心肌线粒体c i r c R NA的差异表达情况及其功能分析.方法以 周龄的d b/d b小鼠构建D CM小鼠模型,C B L/K s J小鼠作为对照.提取两组小鼠心肌组织R NA,高通量测序筛选两组差异表达的线粒体c i r c R NA,使用R T q P C R对差异表达显著的前 个c i r c R NA验证测序结果,并对差异表达c i r c R NA靶基因作功能富集分析,使用m i R NA靶标预测软件对c i r c R NA m i R NA共表达网络分析.结果与对照组比较,D CM组小鼠心肌中 个差异表达的线粒体c i r c
3、 R NA,其中高表达 个、低表达 个.差异表达c i r c R NA在 组 织中 的表 达变 化 与测 序结 果趋 势 一致.GO与K E G G富集 分 析 显 示,差 异 表 达 的c i r c R NA靶基因主要富集在c GMP/P KG、胰高血糖素等通路,与线粒体能量代谢、心肌肥大相关.c i r c R NA m i R NA共表达网络分析发现,表达上调最显著的c h r M:与m i R p、m i R a p、m i R b p有关联,表达下调最显著的c h r M:与m i R b p、m i R b p、m i R p有关联.结论D CM小鼠心肌线粒体存在差异表达的c
4、i r c R NA,且可能与相应m i R NA相互作用,通过调节能量代谢、凋亡等通路影响心肌纤维化、心肌细胞肥大,从而参与D CM的发病.关键词:糖尿病性心肌病;线粒体;c i r c R NA中图分类号:R 文献标志码:AD O I:/j d y x b 收稿日期:修回日期:基金项目:陕西省人民医院科技人才支持计划项目(B J )S u p p o r t e db yT e c h n o l o g yT a l e n tS u p p o r tP r o g r a mo fS h a a n x iP r o v i n c i a lP e o p l esH o s p
5、i t a l(B J )通信作者:刁佳宇E m a i l:d i a o j i a y u c o m网络出版地址:h t t p s:/k n s c n k i n e t/k c m s/d e t a i l/R h t m l()A n a l y s i so f c i r c R N Ae x p r e s s i o np r o f i l ea n df u n c t i o n a l e n r i c h m e n t o fm y o c a r d i a lm i t o c h o n d r i a i nm i c ew i t hd i a
6、 b e t i cc a r d i o m y o p a t h yWANGY i,YOU H o n g j u n,HAN W e n q i,D I AOJ i a y u(T h eS e c o n dC a r d i o v a s c u l a rM e d i c i n eD e p a r t m e n to fS h a a n x iP r o v i n c i a lP e o p l esH o s p i t a l,X ia n ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v eT oe xpl o r et
7、h ed i f f e r e n t i a le xpr e s s i o n a n df u n c t i o n a la n a lys i so fc i r c RNA f r o mmyo c a r d i a lm i t o c h o n d r i ai n d i a b e t e sc a r d i o myopa t hy(D CM)m i c e M e t h o d sT h e D CM m i c e m o d e l w a se s t a b l i s h e di n w e e k o l dd b/d bm i c e,a
8、n dC B L/K s Jm i c ew e r eu s e da sc o n t r o l s RNA w a se x t r a c t e df r o mt h emyo c a r d i u m o ft w ogr o upso f m i c e,h igh t h r o ughpu ts equ e n c i ngw a su s e dt os c r e e n m i t o c h o n d r i a lc i r c RNAd i f f e r e n t i a l lye xpr e s s e di nt h et w ogr o ups
9、,R T qP C R w a su s e dt ov e r i fyt h es equ e n c i ngr e s u l t so ft h ef i r s t c i r c RNA sw i t hs ign i f i c a n td i f f e r e n t i a le xpr e s s i o n,a n df u n c t i o n a le n r i c h m e n ta n a lys i s w a spe r f o r m e d o nt h ed i f f e r e n t i a l lye xpr e s s e dc i
10、 r c RNAt a rge tge n e s,a n d m i RNAt a rge tpr e d i c t i o ns o f t w a r e w a su s e dt oa n a lyz et h ec i r c RNA m i RNAc o e xpr e s s i o nn e t w o r kR e s u l t s T h e r ew e r e m i t o c h o n d r i a l c i r c RNA sd i f f e r e n t i a l lye xpr e s s e di nt h emyo c a r d i u
11、 mo fD CM m i c e,i n c l u d i ng h igh lye xpr e s s e da n d l o we xpr e s s e d T h ee xpr e s s i o npa t t e r no fd i f f e r e n t i a l lye xpr e s s e dc i r c RNA s i nt i s s u e sw a sc o n s i s t e n tw i t ht h o s eo f s equ e n c i ngr e s u l t s T h ee n r i c h m e n ta n a lys
12、 i so fGOa n dK E GGs h o w e dt h a tt h ed i f f e r e n t i a l lye xpr e s s e dc i r c RNAt a rge tge n e sw e r em a i n lye n r i c h e di nc GMP/P KG,gl u c ago npa t h w ays,w h i c h w e r er e l a t e dt o m i t o c h o n d r i a le n e rg ym e t a b o l i s m a n dc a r d i a c hy pe r t
13、 r ophyc i r c RNA m i RNAc o e xpr e s s i o na n a lys i s f o u n dt h a t t h em o s t s ign i f i c a n t lyup r egu l a t e dc i r c R N A,c h r M:,w a sa s s o c i a t e dw i t hm i R p,m i R a p,a n dm i R b p,a n d t h em o s t s ign i f i c a n t lyd o w n r egu l a t e dc i r c RNA,西 安 交
14、通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版c h r M:,w a sa s s o c i a t e dw i t hm i R b p,m i R b p,a n dm i R pC o n c l u s i o n C o mpa r e dt ot h ec o n t r o lm i c e,t h e r ei sd i f f e r e n t i a le xpr e s s i o no fc i r c RNA si n myo c a r d i a lm
15、i t o c h o n d r i ao fD CM m i c e T h ed i f f e r e n t i a l lye xpr e s s e dc i r c RNA sm ayi n t e r a c tw i t ht h ec o r r e spo n d i ngm i RNAt oa f f e c tmyo c a r d i a lf i b r o s i sa n dhy pe r t r ophyt h r o ughr egu l a t i o no fe n e rg ym e t a b o l i s m,apopt o s i sa n
16、 do t h e rpa t h w ays,t h u spa r t i c ipa t i ngi nt h epa t h oge n e s i so fD CMK E Y WO R D S:d i a b e t i cc a r d i o myopa t hy(D CM);m i t o c h o n d r i o n;c i r c RNA细胞的生物学活动受到多种基因共同调控,其中c i r c R NA是一种内源性非编码R NA,由线性R NA以非经典反向剪接方式而形成,呈封闭环状结构,因此,比线性R NA更稳定,且不易被降解 .近年来,越来越多的研究表明,c i r
17、 c R NA充当竞争性内源R NA(c o m p e t i n g e n d o g e n o u s R NA,c e R NA)与m i R NA结合,在细胞中起到m i R NA海绵作用,解除m i R NA对其靶基因的抑制作用,上调靶基因的表达,从而参与多种生理、病理过程,包括肌肉的发育、脑病、肿瘤等 .在糖尿病患者的外周血中也发现c i r c R NA的异常表达,而且异常表达的c i r c R NA可能参与了糖尿病患者的炎症反应过程.糖 尿 病 性 心 肌 病(d i a b e t i cc a r d i o m y o p a t h y,D CM)是糖尿病患者最
18、常见的心血管并发症之一,以心肌细胞过度凋亡、心肌纤维化、心肌细胞肥大为主要病理特点.线粒体是真核细胞内一种重要的细胞器,线粒体不仅是细胞能量代谢的工厂,也参与调节细胞凋亡、氧化应激、钙稳态维持等多种生物学功能.本课题组前期研究发现,线粒体损伤是D CM发病的中心环节,改善线粒体功能有望成为D CM的防治靶点 .线粒体基因组是独立于细胞核染色体外的又一基因组,能够自主复制,是一个含有 k b的环状基因组,编码多肽、核糖体核糖核酸以及转运核糖核酸.目前,来源于线粒体的c i r c R NA已被确定 ,在肌肉、肝脏等线粒体富集的组织中,线粒体c i r c R NA已展现出相应治疗的潜力.有研究发
19、现,过表达线粒体c i r c R NAS C A R可抑制肝脏成纤维细胞的活化并抑制相应的炎症反应.但尚不清楚有关线粒体c i r c R NA是否参与D CM的发病及其机制.本研究采用二代测序技术检测D CM小鼠线粒 体c i r c R NA的表达,筛选出D CM发病相关的线粒体c i r c R NA进一步分析,探讨D CM发病的分子机制,为寻找防治D CM的靶点提供科学依据.材料与方法实验动物及分组所有实验动物购于西安交通大学医学部实验动物中心,动物实验过程符合西安交通大学动物实验委员会制定的动物伦理学标准.实验动物分为D C M组和对照组.周龄的雄性d b/d b小鼠为D C M组
20、,与其对照的C B L/K s J小鼠为对照组,每组只小鼠.D CM小鼠模型的验证用小动物彩色多普勒超声诊断仪(P h i l i p s,荷兰)进行超声心动图检查,取左心室长轴切面与短轴切面测量M型曲线,测量左室收缩末期直径、左室舒张末期直径,连续测量个心动周期的指标,并计算平均值.HE染色:小鼠以 m L/L水合氯醛麻醉后断颈处死,取出心脏,取心底部至心尖部连线中段的心肌组织,常规制成m厚石蜡切片,苏木素伊红染色后脱水、透明、封片.光学显微镜(O l y m p u s,日本)下观察染色效果,镜下拍照,每张切片选取个视野.R N A文库制备与测序利用T r i z o l法分别提取各组小鼠
21、心肌总R NA,并对R NA进行浓度、纯度与完整性质控,质检合格可用于文库制 备.总R NA用r R NA去 除 试 剂 盒(N E B N e x t,美国)去除r R NA后,用T r u S e qS t r a n d e dT o t a lR NA L i b r a r yP r e p试剂盒(I l l u m i n a,美国)构建R NA文库,再用A n g i l e n t 分析系统(A n g i l e n t,美国)检测文库大小和浓度并对文库进行质控.将 p m o l/L文库变性为单链D NA分子,在I l l u m i n a f l o w c e l l
22、(I l l u m i n a,美国)上捕获,原位扩增为簇,并在I l l u m i n aH i S e q(I l l u n i n aH i S e q ,美国)测序平台上采用双端模式进行 个循环测序.差异表达线粒体c i r c R N A的筛选使用C u t a d a p t软件(v)去除接头及低质量r e a d s,获得高质量r e a d s.将高质量r e a d s比对到参考基因组上,再进行c i r c R NA检测和鉴定.并使用c i r c B a s e数据库 和C i r c T r a i t s数 据 库 对 所 鉴 定 的c i r c R NA进行
23、注释,筛选出线粒体来源的c i r c R NA.最后用E d g e R软件(v )分析两组小鼠心肌差异表达c i r c R NA,分别用分层聚类分析法和火山图滤过法鉴定有差异表达的c i r c R NA,以差异倍数和P 作为差异有统计学意义.差异表达c i r c R N A的功能富集分析与m i R N A共网络分析利用GO数 据 库(h t t p:/www g e n e o n t o l o g y 期王毅,尤红俊,韩稳琦,等糖尿病性心肌病小鼠心肌线粒体c i r c R NA表达谱与功能富集分析本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微
24、信公众号:西安交通大学学报医学版o r g)对差异表达的c i r c R NA进行功能富集分析,包括生 物 学 过 程(b i o l o g i c a lp r o c e s s,B P)、细 胞 组 分(c e l l u l a rc o m p o n e n t,C C)与 分 子 功 能(m o l e c u l a rf u n c t i o n,MF)共个 方 面.利 用K E G G数 据 库(h t t p s:/wwwk e g g j p/k e g g/p a t h w a y h t m l)对差异表达的c i r c R NA进行通路富集分析,分析主要
25、参与的信号通路和相关生物学功能.使用m i R a n d a和T a r g e t S c a n两种m i R NA靶标预测软件对c i r c R NA m i R NA相互作用进行预测.差异表达c i r c R N A的验证根据前期高通量测序结果,依据组间差异显著、组内差异小,并且同源性高的原则选取差异表达的c i r c R NA,利用R T q P C R法对其进行验证.T r i z o l法分别提取两组小鼠心肌总R NA,使用P r i m e S c r i p t反转录试剂盒(T a k a r a,日本)将R NA进行反转录为c D NA,再使用S Y B RP C
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