茄子Ⅳ型查尔酮异构酶基因SmCHI2的克隆与分析.pdf
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1、2023年36 卷7 期Vol.36No.7引用格式:周露,崔群香,刘同金,班秋妍,袁颖辉,宁坤,范俊俊,张敏,沈慧玲茄子IV型查尔酮异构酶基因SmCHI2的克隆与分析 J西南农业学报,2023,36(7):1475-1481.Zhou L,Cui Q X,Liu T J,Ban Q Y,Yuan Y H,Ning K,Fan J J,Zhang M,Shen H L.Cloning and analysis of type IV chalcone isomerase gene Sm-CHI2 in eggplantJ.Southwest China Journal of Agricultur
2、al Sciences,2023,36(7):1475-1481.D01:10.16213/ki.scjas.2023.7.015.茄子IV型查尔酮异构酶基因 SmCHI2 的克隆与分析西南农业学报Southwest China Journal of Agricultural Sciences1475周露,崔群香,刘同金,班秋妍,袁颖辉,宁坤,范俊俊,张?敏,沈慧玲(金陵科技学院园艺园林学院,南京2 10 0 38)摘要:【目的】探究茄子花青素合成通路中关键酶SmCHI2的蛋白特性和表达特性,为完善茄子花青素生物合成途径和品质育种提供一定的理论基础。【方法】通过同源克隆获得茄子SmCHI2基因
3、全长序列,利用在线分析工具对其蛋白理化性质进行预测,利用ClustalX1.7、G e n e D o c 2.7.0 和Mega6.0软件进行蛋白序列比对和系统进化树分析,利用qRT-PCR分析SmCHI2基因的表达模式。【结果】SmCHI2基因编码区全长6 33bp,编码2 10 个氨基酸。蛋白理化性质分析显示SmCHI2蛋白分子量为2 3.9 8 kDa,理论等电点为4.8 1,且为不稳定的亲水性蛋白。二级和三级结构预测显示SmCHI2蛋白结构主要包括-螺旋、随机卷曲、延伸链和-转角。多序列比对表明SmCHI2与LcCHI(枸杞AIC33515.1)、L r CH I(黑枸杞AQZ266
4、80.1)、Ca CH I 2(辣椒XP_016573438.1)和St-CHI3(马铃薯XP_006365329.1)等IV型CHI蛋白具有相同的活性和识别位点,且在系统进化树中属于同一分支。亚细胞定位结果显示,SmCHI2蛋白在细胞核、细胞膜和细胞质中均有分布。表达分析显示,SmCHI2基因主要在紫色组织中表达,且在白色果皮中表达量显著低于紫色果皮。【结论】茄子中IV型CHI蛋白SmCHI2正调控茄子花青素的生物合成。关键词:茄子;SmCHI2基因;克隆;生物信息学分析;表达特征;花青素中图分类号:S641.10文献标识码:ACloning and analysis of type IV
5、chalcone isomerase文章编号:10 0 1-48 2 9(2 0 2 3)7-147 5-0 7gene SmCHI2 in eggplantZHOU Lu,CUI Qun-xiang,LIU Tong-jin,BAN Qiu-yan,YUAN Ying-hui,NING Kun,FAN Jun-jun,ZHANG Min,SHEN Hui-ling(College of Horticulture,Jinling Institute of Technology,Nanjing 210038,China)Abstract:ObjectiveThe study aimed to e
6、xplore the protein characteristics and expression characteristics of SmCHI2,a key enzyme in egg-plant anthocyanin synthesis pathway and provide a theoretical basis for improving eggplant anthocyanin biosynthesis pathway and qualitybreeding in the future.MethodThe full-length sequence of SmCHI2 gene
7、was obtained from eggplant by homologous cloning.The physicaland chemical properties of SmCHI2 protein were predicted by online analysis tools,and protein sequence alignment and phylogenetic tree a-nalysis were performed by ClustalX 1.7,GeneDoc 2.7.0 and Mega 6.0 software.And the expression pattern
8、of SmCHI2 gene was analyzedby qRT-PCR.ResultThe full-length coding sequence of SmCHI2 was 633 bp,encoding 210 amino acids.The physicochemical propertiesanalysis showed that the molecular weight of SmCHI2 protein was 23.98 kDa and the theoretical isoelectric point was 4.81.SmCHI2 proteinwas an unstab
9、le and hydrophilic protein.The secondary and tertiary structure prediction showed that SmCHI2 protein mainly consisted of-helix,random coil,extended strand and-turn.Multiple alignment showed that SmCHI2 had the same activity and recognition sites with typeIV CHI protein,including LcCHI(Lycium chinen
10、se AIC33515.1),LrCHI(Lycium ruthenicum AQZ26680.1),CaCHI2(Capsicum annu-um XP_016573438.1)and StCHI3(Solanum tuberosum XP_006365329.1),and they were classified into the same branch in phylogenetictree.The result of subcellular localization showed that SmCHI2 protein was distributed in nucleus,cytome
11、mbrane and cytoplasm.Expressionanalysis showed that SmCHI2 gene was mainly expressed in purple tissues,and the expression level in white peel was significantly lower thanthat in purple peel.ConclusionType IV CHI protein SmCHI2 positively regulates the anthocyanin biosynthesis of eggplant.Key words:E
12、ggplant;SmCHI2 gene;Cloning;Bioinformatics analysis;Expression characteristics;Anthocyanin收稿日期:2 0 2 2-0 8-17基金项目:金陵科技学院高层次人才科研启动项目(jit-b-202053);江苏省种业振兴揭榜挂帅”项目JBGS(2 0 2 1)0 7 4;江苏省农业自主创新项目 CX(21)3028第一作者:周露(19 9 0),女,讲师,主要从事茄果类蔬菜类黄酮代谢调控和分子育种研究。E-mail:1476【研究意义】茄子(Solanummelongena L.)属茄科茄属,因其种植适应范围
13、广且产量高,在蔬菜生产中占据重要地位。紫色茄子果皮中含有丰富的类黄酮化合物花青素。花青素作为一种水溶性的植物色素,它可以赋予植物丰富的颜色。此外,花青素具有吸引昆虫传粉,保护植物免受病原微生物侵染等生物学功能 1-2 。同时,花青素还能有效降低患冠心病、中风和癌症的风险 3。花青素因在植物生理和人类健康上具有上述功能而使其备受关注。查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CH I)作为花青素生物合成途径中的关键酶,探究其蛋白信息及表达特性对完善茄子花青素生物合成调控具有重要作用。【前人研究进展】在类黄酮合成途径中,查尔酮异构酶可催化黄色查尔酮形成无色柚皮素。根据功能和同源关系可将其
14、分为4个亚家族(I型、II型、I型和 IV型 4,其中I型和I 型CHI具有 CHI酶催化活性,可通过催化查尔酮分子内环化反应形成类黄酮及异黄酮等 5,而I型和IV型CHI则不具备查尔酮环化活性 6 。虽然IV型缺乏CHI 环化活性,但它仍可促进植物中类黄酮化合物的产生 7-9 。目前研究者已从康乃馨 10 、烟草 、苹果 12 、茄子 13等多种植物中克隆获得查尔酮异构酶基因。相比黄果草莓,红果草莓中FaCHI基因表达上调,且其表达量与花青素含量呈正相关 14。在海南龙血树和烟草中过表达DcCHII基因和DcCHI4基因可增加类黄酮积累 15。在拟南芥中异源表达茄子SmCHI基因可显著增加转
15、基因植株的花青素含量 13。【本研究切人点】近年来,关于茄子花青素生物合成调控已取得一些研究进展,包括SmCHS、Sm C H I、SmF3H和SmDFR13等结构基因以及SmMYB11316、SmMYB7517、SmM Y B8 6 18 等调节基因在花青素合成途径中的功能已被验证。然而,部分结构基因在茄子中存在多个同源基因,通过探究这些基因的功能,有助于筛选与之结合的调控基因,从而进一步完善茄子花青素合成调控网络。【拟解决的关键问题)本研究在茄子中克隆获得另一个CHI同源基因SmCHI2,通过分析其蛋白水平(理化性质、蛋白结引物名称Primer nameSmCHI2PHB-SmCHI2 C
16、TCTCTCTCAAGCTTGGATCCATGGTAAAGAATGAAGTGSmCHI2-qRTSmAPRT-qRT西南农业学报构、序列比对、进化树分析和亚细胞定位)和表达水平(基于qRT-PCR的组织特异性表达分析),为研究CHI基因功能,完善茄子花青素生物合成途径和品质育种奠定基础。1材料与方法1.1材料种植于南京市金陵科技学院幕府校区园艺站的紫长型茄子栽培种。采集根、茎、叶、果肉、花瓣、萼片、紫色果皮以及套袋处理后的白色果皮,液氮速冻后保存于-8 0 冰箱中,用于RNA提取。1.2茄子总RNA提取及SmCHI2基因的克隆利用植物总RNA提取试剂盒(诺唯赞,南京)提取茄子紫色果皮RNA,随
17、后采用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit(TAKARA,北京)将 RNA反转录为cDNA。利用茄子基因组数据库(https:/sol- http:/eggplant.kazusa.or.jp/)BLAST程序查找茄子中CHI 蛋白的同源基因并将其命名为SmCHI2。使用Primer Premier6软件设计Sm-CHI2 基因的特异引物 SmCHI2-F/R(表1)。以上述cDNA为模板,扩增获得 SmCHI2基因序列。PCR反应液体系包括1LcDNA模板、2 5LPrimeSTARMaxPremix酶、10 mol/L正反引物各1L及2 2 L ddH,0。PC
18、 R 反应程序为9 8 变性10s、58 退火15s、7 2 延伸30 s,35个循环。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,利用凝胶回收试剂盒(诺唯赞,南京)获得目的片段,将其连接到pEASY-Blunt克隆载体(全式金,北京)上后转入大肠杆菌感受态细胞中,挑选PCR检测阳性的单克隆送至生物公司(生工,上海)进行测序,获得Blunt-SmCHI2重组载体,并利用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒提取。1.3茄子SmCHI2基因的生物信息学分析使用ProtParamtool网站分析编码蛋白的理论等电点、分子量、蛋白质水溶性等;利用在线网站SOPMA分析蛋白质的二级结构;通过SWISS MODEL
19、在线网站预测蛋白质三级结构;利用ClustalX1.7表1本研究所用引物Table 1 List of the primers used in the study正向引物(5 3)Forward primerATGGTAAAGAATGAAGTGATGGTGGTGCAGCAATGGAAGGGCAAAACAGGGGTGGAATATGGAACAGACAAGATGG36卷反向引物(5-3)用途Reverse primerPurposeCTATTTAGACAATTCAATAGAAAGAT基因克隆GCCCTTGCTCACCATACTAGTTTTA亚细胞定位GACAATTCAATAGAAAGATTCGGCT
20、TCTGCTAAGCGATCGCGTCAAGAAGCCTAATCGCAGCAG定量定量7期和 GeneDoc 2.7.0软件进行蛋白序列比对;利用Clust-alX1.7和Mega6.0软件进行蛋白进化树分析。1.4茄子SmCHI2蛋白的亚细胞定位以上述Blunt-SmCHI2质粒为模板,设计PHB-SmCHI2-F/R引物(表1)扩增SmCHI2的CDS 片段,利用TAKARA公司的In-FusionHDCloningPlus同源重组酶将其构建至含有黄色荧光蛋白的植物表达载体PHB-YFP上,测序正确后获得重组载体PHB-SmCHI2-YFP。将其转化至GV3101农杆菌菌株中,随后接种于含
21、有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中,2 8 过夜培养使其D60o达到0.6 0.8,离心后去上清,并使用悬浮液(含有蔗糖、乙酰丁香酮和MES的MS液体培养基)进行重悬,静置2 3h后注射至本氏烟草的叶片背面。利用尼康激光共聚焦显微镜检测YFP蛋白的荧光信号。1.5茄子 SmCHI2基因的表达模式分析提取光敏型紫茄的根、茎、叶、花瓣、萼片、果肉、紫色果皮、遮光后白色果皮的总RNA,反转录合成cDNA,以此为模板进行qRT-PCR测定。以SmAPRT为内参,设计qRT-PCR引物(表1)。参照 TB GreenPremixExTaqTMI(T A K A R A,北京)说明书,使用2 0L体系在
22、ABI7500荧光定量PCR检测仪上进行相对表达量的检测,每个组织进行3次生物学重复和技术重复。采用2-AC方法计算得到基因相对于内参的表达水平。根据已发表的茄子转录组数据 19 ,分析光敏型和非光敏型紫茄在套袋光照处理0、0.5、4.0 和8.0 h后SmCHI2基因的表达情况。2丝结果与分析2.1茄子SmCHI2基因的克隆利用茄子基因组数据库(https:/solgenom- http:/eggplant.kazusa.or.jp/)中 BLAST程序查找茄子中CHI蛋白的同源基因。Jiang等 13已报道一个位于茄子第10 号染色体上的SmCHIATGGTAAAGAATGAAGTGATG
23、GTGGATGAAATCCCTTTTCCTTCTCAATTCATGATGAACAATAAGCATTTACCTTTGATGGGACATGGAATAACAGATATAGAGATACACTTTCTCCAAATTAAATTCACTGCAATTGGAGTTTATTTGGATCCAGAAATTGTGACTCATTTGCAGCAATGGAAGGGCAAAACAGGGGAAGAGTTAAATCAAAATGATGAATTCTTTGAGGCTATTGTTAATGCTCAAGTTGATAAGTTCTTGAGAGTAGTAGTGATTAAAGAGATCAAAGGTTCACAGTATGGGGTGCAGCTAGAGAGC
24、GCCATACGCGATCGCTTAGCAGAAGCCGATAAATACGAGGAAGAAGAAGAAGAAGCACTCGAAAAAATCGTTGAATTTTTCCAGTCTAAGTATTTCAAGAAAGATTCAGTCATAACATATTACTTCCCTGCTACTTCTAGTAGTGCAAAGATATCGTTCGCGATAGAAGGTAAGGAAGACTTGGAAATTGAAGTGGAAAATGCAAATGTTGTTGAGATGATGAAGAAATGGTACTTAGGTGGAAGTAGGGGAGTGTCACCTACAACTATTTCTTCTTTGGCTAACAATCTTTCTATTGAA
25、TTGTCTAAATAGMVKNEVMVDEIPFPSQFMMNNKHLPLMGHGITDIEIHFLQIKFTAIGVYLDPEIVTHLQQWKGKTGEELNQNDEFFEAIVNAQVDKFLRVVVIKEIKGSQYGVQLESAIRDRLAEADKYEEEEEEALEKIVEFFQSKYFKKDSVITYYFPATSSSAKISFAIEGKEDLEIEVENANVVEMMKKWYLGGSRGVSPTTISSLANNLSIELSK周露等:茄子IV型查尔酮异构酶基因SmCHI2的克隆与分析M2000 bp1000 bp750bp500 bp250bp100 bp-M:D L 2 0 0
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