牛乳蛋白过敏原检测与改性及低致敏性乳制品研究进展.pdf
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1、专题论述 Journal of Dairy Science and Technology 2023,Vol.46 No.2 42 牛乳蛋白过敏原检测与改性及低致敏性 乳制品研究进展张文华,朱 丽,付尚辰,李林强,刘永峰*(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西 西安 710062)摘 要:牛乳过敏是一种较严重的食源性疾病,通常因为乳中蛋白质和其代谢产物之间发生交互作用而导致人体出现免疫功能紊乱。目前已有研究证明,牛乳过敏逐渐成为全球性的重大公共卫生问题,尤其是在婴幼儿阶段。本文详细阐述酪蛋白、-乳白蛋白和-乳球蛋白的过敏发生机理,介绍目前成功应用于检测牛乳过敏成分的技术并探讨其在实际应用中的
2、不足,列举国内外研究人员利用改性技术研发出的一些低致敏性乳制品,并展望乳过敏原改性的发展方向和低致敏性乳制品的广阔市场前景,为低致敏性乳制品的发展提供一定的理论依据和研究思路。关键词:牛乳;过敏;乳蛋白改性;检测技术;低致敏性乳制品Research Progress in Detection and Modification of Bovine Milk Protein Allergens and Development of Hypoallergenic Dairy ProductsZHANG Wenhua,ZHU Li,FU Shangchen,LI Linqiang,LIU Yongfe
3、ng*(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi an 710062,China)Abstract:Milk allergy is a severe foodborne illness.This disease usually occurs due to the interaction between milk proteins and their metabolites,leading to immune dysfunctions in the body.Milk alle
4、rgy is gradually becoming a major global public health problem,especially for infants and young children.This review elaborates the mechanism behind the allergenicity of bovine casein,-lactalbumin and-lactoglobulin,introduces the technologies that have currently been successfully used in the detecti
5、on of bovine milk allergens,discusses their advantages and disadvantages in practical applications,and systematicallysummarizesthephysical,chemicalandbiologicalmodificationmethodstoreducetheallergenicityofbovinemilk proteins.Finally,some hypoallergenic dairy products developed by researchers in rece
6、nt years are listed,and the future directionsforthedevelopmentofdairyallergenmodificationandthefutureprospectsofhypoallergenicdairyproducts.Thisreview is expected to provide a theoretical basis and research ideas for the development of hypoallergenic dairy products in the future.Keywords:milk;allerg
7、y;milkproteinmodification;detectiontechnology;hypoallergenicdairyproductsDOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20230220-011中图分类号:TS252.1 文献标志码:A 文章编号:1671-5187(2023)02-0042-08引文格式:张文华,朱丽,付尚辰,等.牛乳蛋白过敏原检测与改性及低致敏性乳制品研究进展J.乳业科学与技术,2023,46(2):42-49.DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20230220-011.http:/ZHANG Wenhua,ZHU
8、Li,FU Shangchen,et al.Research progress in detection and modification of bovine milk protein allergens and development of hypoallergenic dairy productsJ.Journal of Dairy Science and Technology,2023,46(2):42-49.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20230220-011.http:/收稿日期:202
9、3-02-20基金项目:陕西省科技计划项目(2022ZDLNY04-09;2022KXJ-010);咸阳市科技计划项目(2021ZDZX-NY-0014);西安市科技计划项目(22NYGG0012)第一作者简介:张文华(2000)(ORCID:0000-0002-5717-2079),男,硕士研究生,研究方向为乳品科学。E-mail:*通信作者简介:刘永峰(1981)(ORCID:0000-0003-2563-0407),男,教授,博士,研究方向为畜产品科学与营养。E-mail:43 2023,Vol.46 No.2 乳业科学与技术 专题论述食物过敏是指人体的免疫系统对某一特定食物产生的一种不
10、正常的免疫反应,具体是指食物中所含的一些蛋白质所引发的变态反应1。近年来,随着食物过敏的发病率逐渐升高,食物过敏已成为世界范围内最受关注的重大公共卫生问题之一。我国最新流行病学调查显示,在我国约有2.69%的婴幼儿对牛乳蛋白发生过敏反应2,可牛乳不但是日常饮食中蛋白质的良好来源,更是母乳缺少时的优秀替代品3。联合国粮农组织和世界卫生组织将牛乳、鸡蛋、鱼、贝类、坚果、花生、小麦、大豆和芝麻认定为九大主要的食物过敏原,婴幼儿则是牛乳过敏的主要受害人群。牛乳过敏是指在牛乳蛋白分子进入血液后,人体免疫系统与其发生过度反应;由于乳制品在幼童时期是必需品,这也导致牛乳过敏成为婴幼儿阶段最常见的食物过敏类型
11、4。部分消费者在食用乳制品后会引起肠胃和呼吸道不适,极少数人还会引起休克或死亡5-6。当前,牛乳过敏无法完全治愈,此类患者不得不严格避免摄入含有乳蛋白的部分乳制品,在很大程度上影响了对牛乳过敏人群的身体健康和生活质量7。所以降低乳蛋白致敏性和开发低致敏性乳制品是食品领域亟待解决的问题。针对牛乳过敏问题,现阶段研究热点主要在对牛乳过敏蛋白进行改性和寻找其主要致敏表位方面。最近的研究表明,还可以通过益生菌来调节人体免疫反应,从而起到缓解过敏反应的作用。Basturk等8研究表明,鼠李糖乳杆菌可显著缓解牛乳过敏患者的过敏症状。因此,利用合适的益生菌对过敏性乳蛋白进行改性可能成为开发低致敏乳制品的新研
12、究热点。本文综述牛乳中主要的蛋白过敏原及其发生机理、过敏原的检测技术与改性方法,旨在为开发低致敏性牛乳制品提供可靠的理论依据。1 牛乳过敏的过敏原及其发生机理大部分牛乳蛋白可能都会引起过敏,通常认为牛乳过敏中最常见的过敏源是酪蛋白(casein,CN)、-乳球蛋白(-lactoglobulin,-LG)和-乳白蛋白(-lactalbumin,-LA),构象表位和线性表位是它们的共同特征,细胞上的这2 种表位在被人体免疫系统识别后会表现出致敏性。而牛血清白蛋白、乳铁蛋白(lactoferrin,LF)等则被认为是次要过敏原9-10。牛 乳 过 敏 的 介 导 类 型 分 为 免 疫 球 蛋 白
13、E(immunoglobulin E,IgE)、非IgE和二者兼有,其中第1种类型介导的过敏反应最多11。IgE介导的免疫应答是指在人体初次接触到牛乳过敏原的情况下,乳蛋白经过树突状细胞的吸收处理后,迅速呈递给初始的CD4淋巴细胞,这些淋巴细胞在过敏原和其他因子的刺激下,将不断分化成不同的效应T细胞,比如Th1、Th2、Th17和Treg等,然后则会刺激B细胞合成免疫抗体,再使肥大细胞与特定的Fc受体结合,最后这个结合受体与过敏原蛋白相结合,使机体处于致敏阶段12。非IgE介导的类型主要包括食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征、过敏性直肠结肠炎、肠病等,这些疾病多由牛乳蛋白引起,主要发病人群为婴幼儿
14、和儿童13。但目前非IgE介导背后的免疫机制仍不明确,缺乏特异性实验室指标和生物标志物,主要依靠病史、临床症状和具有较高过敏反应风险的口服食物激发实验来诊断。牛乳过敏的原因有两方面,一是乳中蛋白质的组成和含量与人乳有较大差异,二是与人体消化系统和胃肠黏膜的免疫能力紧密相关14。免疫过敏反应涉及到对蛋白质表位进行免疫识别,根据蛋白质表位的结构变化,将其分为构象表位(由序列上没有相连的氨基酸残基经过折叠而形成的结构)和线性表位(由序列上有连接的氨基酸残基经过共价键而形成的结构)15-16。酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质,分为s1-CN、s2-CN、-CN和-CN。研究17表明,酪蛋白中免疫原性相对较强
15、的肽段是s2-CN对应的肽段Ile86-Phe103,其与血清IgE反应的强弱程度差异较大,且与乳中4 种酪蛋白的比例相关。牛乳-LA与人乳-LA的氨基酸序列具有高度相似性,但人乳蛋白质是过敏性最低的,且人乳中的-LA并不是一种主要过敏原,这表明牛乳-LA的构象表位在其过敏原性上起着重要作用18。动物实验模型 显示19,在-LA的三级结构中肽段Val42-Asp49是过敏表位,-LA中成环肽段Trp60-Met80和Cys91-Leu96是其主要的抗原位点。而胃蛋白酶不能消化水解-LG,因此其可自由穿过胃肠道进入血液循环中,在其三级结构中肽段Pro48-Glu55是过敏表位,90%牛乳过敏患者
16、的血清能识别的-LG肽段为Val41-Trp60、Tyr102-Arg124和Leu149-Ile16220。由于这些过敏原在结构和作用上并没有很大的共同点,所以很难完全清除它们,另外这对牛乳本身也是一种巨大的营养损失。2 乳制品过敏源检测技术目前,针对过敏物质的检测技术有很多,根据检测原理可以将其分为3 种:过敏原DNA聚合酶链反应法、过敏原蛋白色谱法和免疫测定法。由于牛乳中几乎不含与变应性有关的DNA,因此最常用的检测技术则是色谱技术和免疫学技术,包括生物传感器法、高效液相色谱-质谱联用(high performance liquid chromatography-mass spectro
17、metry,HPLC-MS)法、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法和其他方法等。专题论述 Journal of Dairy Science and Technology 2023,Vol.46 No.2 44 2.1 生物传感器检测技术生物传感器主要包括食物适配体传感器、食物免疫原传感器、酶传感器、微生物传感器等,其中免疫原和适配体传感器可快速且简单地测定牛乳中的多重过敏原。HongLiping等21将荧光检测技术与适配体相结合,开发具有高灵敏度和简单检测程序的生物传感器,为检测过敏原酪蛋白与乳清蛋白提供了可行的策略,荧光团以标
18、记或非标记的方式与适配体结合,分析物浓度和其他信息通过激发光和识别元件的相互作用反映。Jiang Donglei等22提出并开发了一种新的多功能、制作简单、一次性的电化学肥大细胞传感器,成功用于灵敏测定牛乳中的主要过敏原酪蛋白,其电化学检测结果与传统的扫描电镜、透射电镜和Ca2浓度测定结果一致,检测限为32 ng/mL。因此,生物传感器方法可用于乳品过敏原的定量检测,有效避免了复杂的操作和耗时的预处理,将成为现场监管时用于测定各种乳品过敏原的重要技术。但生物传感器的应用局限性比较多,用于检测牛乳过敏原的适体传感器仍处于初级发展阶段,抗体的不稳定性和高成本等限制了适体传感器的发展。虽然适体的高度
19、特异性反应可以解决检测器的交叉反应问题,但当其他类似物共存或靶标浓度较低时,这种微弱的非特异性信号的影响不能忽视。因此,提高特异性适体筛选技术水平是未来适体技术特异性研究的方向之一,相信科研人员能够在实际应用中逐步克服适体荧光传感器的技术难题,并使其在环境检测、健康和医疗领域得到更广泛的应用。2.2HPLC-MS法过敏原的定量分析推动了检测技术向靶向MS法的发展,而液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法正是利用了其在单一分析实验中有着多重定量的能力。相比之下,LC-MS具有灵敏度高、特异性强、重复
20、性好等特点,它选择蛋白水解肽作为过敏原蛋白的区别性特征,并在可调的提取、消化和仪器条件下选择性优化,主要用于过敏原的定量检测。Ansari等23用胰蛋白酶初步消化牛乳蛋白,再通过MS技术对牛乳水解产物中的-CN、-LA和-LG的特征肽进行检测,其中LIVTQTMK不仅是-LG的标志性肽,还是其主要的IgE表位肽,其检出限为1.11 ng/mL,该方法是建立免疫分析方法的可能替代和比较方法的第1步,可作为测定不同食品中牛乳过敏原的参考方法。LC-MS是将色谱与MS技术结合起来的有效手段,不但分析范围广、纯化能力强、定性分析结果也较稳定;该方法具有快速、高自动化以及同时检测单一或多种靶蛋白的能力,
21、但在此过程中,对预加工要求会变 得更高。2.3ELISA法ELISA法具有特异性强、速度快和易操作等诸多优点,是检测过敏原-LG最成熟的方法之一。根据ELISA检测类型可分为间接竞争ELISA(competitorELISA,cELISA)和夹心ELISA(sandwichELISA,sELISA)。何圣发等24比较cELISA和sELISA检测牛乳过敏原-LG的灵敏性和特异性,发现sELISA比cELISA更加灵敏,线性关系也更好,且前者对牛乳和非牛乳制品的区分更加准确;可能是因为后者只需要一种特异性抗体,而前者却需要2 种特异性抗体,对比之下,sELISA的特异 性更强。作为一种免疫检验技
22、术,ELISA法仍有不小的局限性。若在所检测的样本中含有乳清类的物质,则会成为干扰实验的因素,而且在实验过程中,影响结果的因素也很多,尤其是进行ELISA测定时样品的预处理和环境对测定结果影响较大。因此,ELISA在实验时容易受重复性差、本身抗体和嗜异性抗体等的干扰,这时实验结果极易出现假阳性。2.4 其他方法聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是基于过敏物质DNA检测的方法。PCR技术是使用特异性引物通过PCR扩增最初目标DNA序列,从而使检测
23、结果具有高度特异性,Kppel等25研发了2 种可同时检测乳品中几种过敏原的六重实时PCR系统,2 种测试系统对分析物都表现出良好的特异性和至少0.1%的检测限。LAMP是一项相对较新的DNA扩增技术,若要在等温条件下快速实现DNA的指数式增长,可以使用LAMP法在特定的DNA聚合酶和4 条引物存在的情况下,特异性识别靶序列上的6 个位点26。Kim等27 开发了一种直接的双联实时LAMP测定法,用于同时检测牛乳和山羊乳,发现此法的最低检测限分别达到0.1、1.0 pg。与传统的PCR方法相比,本方法具有检出限低、成本低、耗时短、技术要求低等优点,在检测乳过敏原中具有广阔的应用前景。与蛋白质不
24、同,DNA分子即使在剧烈的食品加工过程中也保持着一定的完整性。DNA分子的扩增检测技术快速、稳定性强、不易发生交叉反应、分析成本适中。在实际检测中,应根据具体情况选择合适的检测方法。3 乳制品过敏源改性方法近几年来,降低乳过敏性的研究热点都聚焦在对乳蛋白质进行改性上,所谓蛋白质改性就是利用物理、化学和生物法改变氨基酸残基和多肽链,使蛋白分子的空间结构和理化性质发生变化,从而获得具有更好功能特45 2023,Vol.46 No.2 乳业科学与技术 专题论述性和营养特性的蛋白质。其中物理法包括超声波处理、加压改性、射线辐照及热处理;化学法包括糖基化和其他化学修饰法;生物法包括发酵改性、基因技术、酶
25、法交联和酶法水解。3.1 超声波处理超声处理广泛应用于食品加工、化学、医药和农业等诸多领域,目前其在乳品行业中的应用研究主要集中在清洗工具、灭菌、乳化和均质方面28,乳品工厂合理利用此技术能节约大量时间。但超声波处理在降低牛乳过敏性方面仍是一种新兴技术,在乳制品中,高功率超声波通过液体介质时会产生空化效应,液体中溶解的气泡在超声波的作用下发生振荡,随着时间的推移,多个气泡之间会逐渐结合,当气泡达到一定尺寸时会发生溃灭29,而能量的释放会使介质的温度和压力升高,这些效应会引发蛋白质天然结构发生改变,造成二级结构改变、分子间发生相互作用和二硫键重组等变化30,这些变化对牛乳蛋白致敏性均会产生重大影
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