镍纹蛋白样β对脂多糖诱导心肌细胞损伤的抑制作用及其机制.pdf
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1、山东医药2023 年第 63 卷第 23 期镍纹蛋白样对脂多糖诱导心肌细胞损伤的抑制作用及其机制曹红1,张小萌2,许琮11 华中科技大学同济医学院附属同济医院综合科,武汉430030;2 华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科摘要:目的探讨镍纹蛋白样 (Metrn)对脂多糖(LPS)诱导心肌细胞损伤的抑制作用及其可能的机制。方法取对数生长期的H9c2心肌细胞,将其分为LPS组、Metrn组、Metrn+LPS组及对照组。LPS组、Metrn组、Metrn+LPS组分别给予1 mg/L LPS、200 ng/mL Metrn、1 mg/L LPS+200 ng/mL Metrn,对照组给予等体
2、积PBS,作用12 h。采用MTT法检测细胞增殖情况,ELISA法检测乳酸脱氢酶(LDH)、炎症反应相关因子 肿瘤坏死因子(TNF-)、白细胞介素(IL)-1、IL-6、氧化反应相关因子 活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)及抗铁死亡蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)表达,Western blotting法检测炎症信号分子Toll样受体4(TLR4)、Gpx4蛋白相对表达量,总铁比色法检测细胞游离铁(Fe2+)含量。结果与Metrn组、对照组比较,LPS组及Metrn+LPS组细胞LDH、TNF-、IL-1、IL-6、ROS、MDA 表达均升高,细胞增殖率及 GSH、Gpx
3、4 表达均降低,且 LPS 组变化更明显(P均0.05)。与Metrn组、对照组比较,LPS组及Metrn+LPS组细胞Fe2+含量升高、Gpx4蛋白相对表达量降低,且 LPS 组变化更明显(P 均0.05)。与Metrn组、对照组及Metrn+LPS组比较,LPS组TLR4蛋白相对表达量升高(P均0.05)。结论Metrn可以减轻LPS引起的心肌细胞损伤,其机制可能与减轻细胞氧化应激反应、炎症反应及铁死亡有关。关键词:镍纹蛋白样;脂多糖;铁死亡;Toll样受体4;氧化应激;炎症反应;心肌细胞;脓毒血症心肌病doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2023.23.001 中图
4、分类号:R453 文献标志码:A 文章编号:1002-266X(2023)23-0001-04Inhibitory effect of Metrn on lipopolysaccharide-induced cardiomyocyte injury and the mechanismCAO Hong1,ZHANG Xiaomeng,XU Cong1 Department of Geriatrics,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,C
5、hinaAbstract:Objective To investigate the inhibitory effect and mechanism of Metrn on lipopolysaccharide-induced myocardial injury.Methods H9c2 cells in the logarithmic growth stage were divided into the LPS group,Metrn group,Metrn+LPS group,and control group.Cells in the LPS group,Metrn group and M
6、etrn+LPS group were given 1 mg/L LPS,200 ng/mL Metrn and 1 mg/L LPS+200 ng/mL Metrn,respectively,while cells in the control group were given equal volume of PBS for 12 h.Cell proliferation rate was detected by MTT assay.ELISA was used to detect lactate dehydrogenase(LDH),inflammatory response-relate
7、d factors tumor necrosis factor(TNF)-,interleukin(IL)-1,and IL-6,oxidative response-related factors reactive oxygen species(ROS),malondialdehyde(MDA),and glutathione(GSH)and anti-ferroptosis protein glutathione peroxidase 4(Gpx4).Western blotting was used to detect the Toll-like receptor 4(TLR4)and
8、Gpx4 protein,and total iron colorimetry was used to detect the Fe2+concentration of cells.Results Compared with the Metrn group and control group,the expression levels of LDH,TNF-,IL-1,IL-6,ROS and MDA increased in the LPS group and Metrn+LPS group,and the cell proliferation rates and the expression
9、 levels of GSH and Gpx4 decreased,and the changes were more significant in the LPS group(all P0.05).Compared with the Metrn group 论著 基金项目:国家自然科学基金资助项目(82270748)。第一作者简介:曹红(1986-),女,主治医师,主要研究方向为心血管疾病的基础与临床。E-mail:通信作者简介:许琮(1987-),女,主治医师,主要研究方向为老年疾病的基础与临床。E-mail:doctor123456789TJ开放科学(资源服务)标识码(OSID)1山东医
10、药2023 年第 63 卷第 23 期and control group,the Fe2+content of cells increased and the relative expression of Gpx4 protein decreased in the LPS group and Metrn+LPS group,and the changes were more significant in the LPS group(all P0.05).Compared with the Metrn group,control group and Metrn+LPS group,the rel
11、ative expression level of TLR4 protein in the LPS group increased(P0.05).Conclusion Metrn alleviates LPS-induced injury in cardiomyocytes,which may be related to inhibiting oxidative stress,inflammation,and ferroptosis.Key words:Metrn;lipopolysaccharide;ferroptosis;TLR4;oxidative stress;inflammatory
12、 response;cardiomyocytes;septic cardiomyopathy脓毒血症是ICU常见疾病,其引起的心脏损伤和心功能障碍是导致患者死亡和预后不良的主要原因之一。目前认为,脓毒血症引起的心脏炎症可能与铁死亡有关,而铁死亡在心血管疾病尤其是急性心脏损伤中发挥重要作用1-2。铁代谢异常可引起游离铁(Fe2+)浓度增高,膜磷脂重构使得细胞对过氧化连锁反应的敏感性增加,铁介导的类Fenton反应可促进脂质自由基和脂质过氧化物的产生,脂质过氧化物清除系统功能障碍导致其清除不足,这一系列过程最终引起脂质过氧化物蓄积并引发细胞死亡3。因此,抑制心肌细胞铁死亡可能是防治脓毒血症心脏损伤
13、的有效方法。镍纹蛋白样(Metrn)是最近发现的一种由骨骼肌和脂肪组织产生的激素,在运动和冷暴露刺激下分泌增加4。Metrn通过在脂肪库中诱导交替激活的巨噬细胞,以及促进脂肪组织褐变来促进能量消耗,与先天免疫、获得性免疫和炎症通路相关5-8。在冠心病患者中,血清Metrn水平与心血管事件及患者预后密切相关,并且可减轻肿瘤治疗中与化疗相关的心脏毒性8。2021年3月2022年5月,本研究观察了Metrn对脂多糖(LPS)诱导心肌细胞损伤的抑制作用,并探讨是否与调控炎症反应、氧化应激反应及铁死亡有关。现报告如下。1 材料与方法 1.1材料细胞:H9c2心肌细胞购自上海中国科学院细胞典藏中心。主要试
14、剂:DMEM培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司,MTT试剂盒购自美国 Abcam 公司,DCFH-DA 荧光探针购自美国 Med Chem Express公司,抗铁死亡蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)活性试剂盒购自美国Beyotime公司,心肌细胞损伤标志物乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自上海碧云天科技有限公司,炎症反应相关因子 肿瘤坏死因子(TNF-)、白细胞介素(IL)-1、IL-6 试剂盒均购自美国Biolegend公司,氧化反应相关因子 活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒购自上海碧云天科技有限公司,细胞炎症信号分子Toll样受
15、体4(TLR4)抗体购自美国Abcam公司。1.2细胞分组及处理将H9c2心肌细胞置于含有10%小牛血清的DMEM培养基中,于37、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期的H9c2细胞,将其分为LPS组、Metrn组、Metrn+LPS组及对照组。LPS组、Metrn组、Metrn+LPS组分别给予1 mg/L LPS、200 ng/mL Metrn、1 mg/L LPS+200 ng/mL Metrn,对照组给予等体积PBS,作用12 h。1.3细胞活性检测采用MTT法。各组细胞分组处理后去除培养基,PBS清洗,每孔加入 MTT溶液10 L,室温孵育30 min,使用酶标仪检测450 nm处的
16、 光 密 度(OD)值。细 胞 增 殖 率=(OD实验孔OD对照孔)/OD对照孔100%。1.4细胞 LDH、炎症反应相关因子检测采用ELISA法。取各组分组处理后的细胞,每孔加入裂解液50 L,孵育15 min;收集裂解后的细胞,离心后吸取上清。使用试剂盒检测细胞LDH、TNF-、IL-1、IL-6表达,严格按照试剂盒说明书操作。1.5细胞氧化反应相关因子及Gpx4活性检测采用ELISA法。将H9c2细胞以1104/孔接种于96孔板,参照“1.2”进行分组处理,每孔加入DCFH-DA荧光探针 1 L,室温下孵育 20 min,采用不含血清的DMEM培养基清洗。使用酶标仪检测各组细胞的荧光强度
17、,以此表示ROS含量,严格按照试剂盒说明书操作。将H9c2细胞以1104/孔接种于6孔板,参照“1.2”进 行 分 组 处 理,加 入 SDS 裂 解 液 孵 育30 min,收集细胞裂解液,离心后取上清,在酶标仪下检测OD值,以此表示MDA、GSH和Gpx4活性,严格按照试剂盒说明书操作。1.6细胞Fe2+检测采用总铁比色法。取各组分组处理后的细胞,加入裂解液孵育15 min,收集裂解液,离心后取上清进行样本测定。标准孔中加入100 L分析缓冲液,样品孔中加入5 L样品并用分析缓冲液稀释至100 L/孔。在每个标准孔中加入5 L 铁还原剂,每个样品孔中加入 5 L 分析缓冲液,37 条件下孵
18、育30 min。加入Fe2+探针100 L,室温下避光孵育1 h。采用酶标仪检测各组在波长593 nm处的OD值,根据标准曲线计算Fe2+含量,严格按照试剂盒说明书操作。2山东医药2023 年第 63 卷第 23 期1.7 细 胞 TLR4、Gpx4 蛋 白 检 测 采 用 Western blotting法。取各组分组处理后的细胞,加入SDS裂解液孵育30 min,收集细胞裂解液,离心后取上清,检测蛋白浓度后定量为3 000 ng/mL。SDS-PAGE电泳蛋白样本,转膜后采用5%羊血清封闭1 h,加入抗TLR4、Gpx4 及 内 参 GAPDH 一 抗(稀 释 比 例 为1 1 000),
19、4 温孵过夜;加入二抗(稀释比例为1 1 000),室温孵育1 h。加入显影液进行显色反应,凝胶系统扫描,Image J软件分析条带灰度值,计算TLR4及Gpx4蛋白相对表达量。1.8统计学方法采用SPSS23.0统计软件。计量资料采用 Shapiro-Wilk 正态性检验,呈正态分布以-x s表示,多组间比较采用方差分析,两组间比较采用t检验,重复测量数据采用重复测量的方差分析;非正态分布以M(P25,P75)表示,组间比较采用秩和检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1各组细胞增殖率比较LPS 组、Metrn+LPS组、Metrn组及对照组细胞增殖率分别为40.49%10.68
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