美洲大蠊多肽和顺铂联用对HepG2细胞凋亡及自噬的影响.pdf
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1、井冈山大学学报(自然科学版)69文章编号:1674-8085(2023)04-0069-06美洲大蠊多肽和顺铂联用对HepG2细胞凋亡及自噬的影响8陈莉,齐烨迪,李智,*余丽双(福建中医药大学药学院,福建,福州350122)摘要:采用MTT法检测美洲大蠊多肽(PAP-3)与不同浓度的顺铂(DDP)单用或联合使用对人肝癌HepG2细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PAP-3、DDP单独或联合给药干预对HepG2细胞凋亡的影响;WesternBlot检测PAP-3、DDP单独或联合给药后HepG2细胞内自噬相关蛋白p62、LC3、Beclin-1、Atg5及PI3K的表达。实验结果显示,与DDP单
2、独给药相比,PAP-3与DDP联合给药对HepG2的细胞的抑制作用更强;PAP-3与DDP联合给药组中细胞的凋亡率与DDP和PAP-3单独给药组相比均有升高(P0.05)。与对照组相比,DDP组中,p62蛋白水平降低,LC3II蛋白水平升高,LC3II/I的比例也升高,表现出细胞自噬流的活化;与DDP组相比,联合给药组中p62蛋白水平回升,LC3II蛋白水平和LC3II/I的比例均有回落。且联合给药组中PI3K、Atg5、Beclin-1等自噬相关蛋白的量均较DDP组减少,而凋亡相关的Caspase-3蛋白的表达量则较DDP组增加。据此推测,PAP-3和DDP的联用可以通过抑制HepG2细胞自
3、噬相关蛋白的表达水平,抑制DDP带来的细胞自噬水平的升高,增加细胞对DDP的敏感性,从而诱导HepG2细胞凋亡。关键词:美洲大蠊多肽;肝癌;凋亡;自噬;顺铂中图分类号:Q255文献标志码:ADOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2023.04.011EFFECTS OF PERIPLANETAAMERICANA PEPTIDE COMBINED WITHCISPLATIN ONAPOPTOSISANDAUTOPHAGY OF HEPG2 CELLSCHEN Li,QI Ye-di,LI Zhi,*YU Li-shuang(Pharmacy College,Fujian Un
4、iversity of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China)Abstract:MTT assay was used to detect the effects of Periplaneta americana peptide(PAP-3,sequenceIPMTPAGI-NH2)and cisplatin(DDP)alone or in combination on the proliferation of HepG2 cells.The effects ofPAP-3 and DDP alone or in comb
5、ination on apoptosis in HepG2 cells were detected by flow cytometry.Westernblotting was used to detect the expression levels of autophagy associated proteins p62,LC3,Beclin-1,Atg5 andPI3K in HepG2 cells after drug administered in each group.Compared with DDP alone,the combinedadministration of PAP-3
6、 and DDP had stronger cytostatic effects on HepG2 cells.The apoptosis rate of PAP-3 andDDP combined group was higher than that of DDP and PAP-3 alone group(P 0.05),and the trend was similar tothat of DDP+3-MA group.Compared with the control group,the p62 protein level in DDP group was significantlyd
7、ecreased,the LC3 protein level and the LC3II/I ratio were increased,showing the activation of autophagy flow.In contrast,in the PAP-3+DDP combined administration group,the p62 protein level increased,while the levelof LC3II protein and the ratio of LC3II/I both decreased.The amount of autophagy rela
8、ted proteins such as PI3K,ATG5 and Beclin-1 in the PAP-3+DDP combined administration group was lower than that in the DDP group,收稿日期:2022-9-14;修改日期:2023-01-16基金项目:国家自然科学青年基金项目(81903855)作者简介:*余丽双(1982-),女,福建莆田人,副教授,博士,主要从事中药质量控制研究(E-mail:).第44卷第4期Vol.44 No.4井冈山大学学报(自然科学版)2023年7月Jul.2023Journal of Jin
9、ggangshan University(Natural Science)69井冈山大学学报(自然科学版)70while the expression of apoptosis related caspase-3 protein was higher than that in the DDP group.Thecombination of PAP-3 and DDP could increase the sensitivity of the cells to DDP and induce apoptosis of HepG2cells by inhibiting the expression
10、of autophagy-related proteins and inhibiting the increase of autophagy levelcaused by DDP.Key words:Periplaneta americana peptide;liver cancer;apoptosis;autophagy;cisplatin肝癌是全球最常见的五大致命恶性肿瘤之一,其发病率逐年增加1。据统计,2020年全球肝癌新发患者为905677例,死亡患者为830180例2。目前,对于肝癌最有效的治疗方式是手术治疗,但由于肝癌早期症状不典型,多数患者就诊时已处于中晚期,错过了手术时机,且肝
11、癌术后易转移,患者5年复发率高达60%。针对晚期肝癌患者,临床多采用放、化疗等手段进行治疗3。顺铂作为临床上肝癌化疗的一线药物,其大剂量服用可引起患者严重的肾功能损害和胃肠道毒副反应,且长期服用顺铂易产生耐受,影响治疗效果4-5。因此临床上迫切需要更多有效的辅助药物,通过联合用药降低顺铂的用量和毒性反应,减少耐药性,增强其抗癌治疗效果。自噬在肝癌、肺癌、前列腺癌等肿瘤细胞DDP耐药过程中发挥重要作用6,抑制自噬有可能使肿瘤细胞对药物的敏感性提升和消除耐药,使化疗药物的用量得以下降,进一步使毒副作用减少。美洲大蠊(Periplanetaamericana L.)为昆虫纲蜚蠊目昆虫,入药始载于神农
12、本草中,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用7。有研究显示美洲大蠊多肽PAE2能够通过下调AMPK的表达进而抑制自噬,从而逆转BEL-7402/5-FU细胞的多药耐药性8。本实验室前期从美洲大蠊提取物中分离鉴定出多个活性多肽,其中活性多肽PAP-3(序列IPMTAPGI-NH2,以下简称PAP-3)对肝癌细胞HepG2的增殖有抑制作用。将美洲大蠊多肽与DDP联用,通过影响细胞自噬抑制肿瘤活性的研究国内外暂时没有报道。本研究在HepG2细胞中联用PAP-3与DDP,初步探索PAP-3增加DDP的敏感性、抑制肿瘤细胞的机制,为DDP及美洲大蠊多肽的临床应用提供实验基础。1实验材料1.1药物美洲大蠊多肽(
13、序列IPMTAPGI-NH2,简称PAP-3)购自吉尔生化上海有限公司,磷酸盐缓冲液PBS配制成浓度为10 mgmL-1的母液,-20分装保存,实验时用培养基将药物母液稀释至相应浓度即可。顺铂(Cisplatin,DDP)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)购于MedChemExpress公司。1.2细胞人肝癌HepG2细胞为本实验室保存,用含10%FBS和1%青-链霉素的高糖DMEM培养基培养于37、5%CO2的恒温培养箱中。1.3试剂磷酸盐缓冲液、青-链霉素、DMEM培养基等试剂(Hyclone公司);胎牛血清(PAN-Biotech公司);胰蛋白酶(Gibco公司);噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜
14、(DMSO)(Sigma公司);Annexin V-FITC/PI试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、SDS-PAGE电泳液、Western转膜液、ECL Plus、1M Tris-HCl(pH8.8)、Bovine Serum Albumin、吐温20(碧云天生物技术研究所);脱脂奶粉(上海源叶生物科技有限公司);LC3B、PI3K、-actin、Atg5和Caspase-3等抗 体(Cell Signaling Technology公司);p62、Beclin-1等抗体(Santa Cruz公司);二抗(Merck
15、Millipore公司)。1.4仪器XS105电子分析天平(Mettler Toledo公司);MILLI-Q超纯水装置(MILIPOR公司);CO2细胞培养箱(Thermo公司);倒置显微镜(OLYMPUS);井冈山大学学报(自然科学版)71Infinite M200 Pro多功能酶标仪(TECAN);小型槽式转印系统、电泳槽、化学发光成像系统(Bio-Rad公司)。2实验方法2.1 MTT法检测PAP-3、DDP单独及联合应用对HepG2细胞增殖的影响9取对数生长期的HepG2细胞按5103细胞/孔的密度接种于96孔板中,待过夜细胞贴壁后,按各分组浓度给药干预24 h,弃去孔内原培养基,每
16、孔加入110 L的5 mgmL-1MTT溶液,于37、5%CO2培养箱中继续孵育4 h,弃上清后每孔加入150 L的DMSO,振摇10 min使结晶体全部溶解,于Infinite M200 Pro酶标仪中测定562 nm处吸光度,依下述公式(1)计算细胞抑制率(IR):IR(%)=(1-实验孔A值/对照孔A值)100%(1)2.2流式细胞法检测药物干预后对HepG2细胞凋亡的影响对数生长期的HepG2细胞按3105细胞/孔接种于6孔板中,待过夜细胞贴壁后弃去原培养基,按照各分组给药干预24 h后收集细胞,制备成单细胞悬液,按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书进行双染操作,染色完成
17、后避光反应一段时间上流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.3 Western Blot法检测PAP-3和DDP联用对细胞自噬的影响取对数生长期的HepG2细胞按3105细胞/孔接种于6孔板,待细胞过夜贴壁后,各浓度给药干预24 h后收集细胞,加入细胞裂解液提取细胞总蛋白,95度加热变性10 min,用BCA试剂盒定量。分别加入上样缓冲液,以western blot方法检测各组相应蛋白的浓度变化。使用Imagine J软件分析条带灰度值。2.4统计学方法实验数据统计分析采用SPSS 21.0统计软件和OriginPro8.0作图软件,计量资料以平均值标准差(XS)表示,组间比较使用单因素方差进行分析,P
18、 0.05表示差异有统计学意义。3实验结果3.1 MTT法测定PAP-3联合DDP对HepG2细胞增殖的影响MTT结果显示,单独用DDP处理24 h后,HepG2细胞的存活率随着DDP浓度的增加而降低。当DDP浓度为0.75、1.5、3、6、12 gmL-1时,对HepG2细 胞 抑 制 率 分 别 为(3.36 5.76)%、(10.03 2.57)%、(29.95 4.47)%、(45.104.54)%、(71.28 3.49)%,半数抑 制浓度(IC50)为6.374 gmL-1。联合用药时,DDP和PAP-3终浓度分别为0.75+12.5、1.5+25、3+50、6+100、12+20
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