聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究.pdf
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1、版),2 0 2 3,44(4):7 6-8 3,8 9.引文格式:周颖,魏文志.聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究J.扬州大学学报(农业与生命科学Jul.2023Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2023年7 月Vol.44 No.4第44卷第4期扬州大学学报(农业与生命科学版)D0I:10.16872/ki.1671-4652.2023.04.010聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究周装颖,魏文志(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州2 2 50 0 9)摘要:聚六亚甲基
2、双胍(polyhexamethylene biguanide,PH M B)是一种高分子聚合物杀菌消毒剂,在医药、日用化工和水产养殖等行业广泛应用。为探究PHMB对水生植物的毒性效应,设置0、1、2、4mgL-1浓度的PHMB对蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)进行O、3、6 和9d的胁迫试验。结果表明:PHMB对蛋白核小球藻的生长具有抑制作用,且随胁迫浓度的升高而增强。PHMB显著降低蛋白核小球藻叶绿素a和b含量,引起藻细胞的细胞壁开裂和内含物外渗,损伤细胞器结构。PHMB显著降低蛋白核小球藻中抗氧化酶超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性,并引起丙二醛含量升高。对蛋白
3、核小球藻光合作用相关基因pbsA、r b c L和rbcS的表达检测发现,这些基因在低浓度的PHMB处理后表达升高,而在高浓度的PHMB处理后表达下降,说明小球藻对PHMB胁迫产生反馈调节。综上,PHMB可抑制蛋白核小球藻的光合作用及生长,为PHMB的生态风险评估提供了理论依据。关键词:蛋白核小球藻;聚六亚甲基双胍;抗氧化酶;光合作用基因中图分类号:X171.5文献标志码:A文章编号:16 7 1-46 52(2 0 2 3)0 4-0 0 7 6-0 8Toxic effects of polyhexamethylene biguanide(PHMB)on Chlorella pyrenoi
4、dosaZHOU Ying,WEI Wenzhi(College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)ABSTRACT:As a macromolecule polymer disinfectant,polyhexamethylene biguanide(PHMB)is widely used in medi-cine,chemical,aquaculture and other industries.To study the phytotoxic effects of PHMB,
5、Chlorella pyrenoidosa wasexposed to PHMB at 0,1,2 and 4 mg L-1 for 0,3,6 and 9 d,respectivily.The results indicated that PHMB inhibitedthe growth of C.pyrenoidosa and represent in a time-dose effect.Meanwhile PHMB significantly reduced the content ofchlorophyll a and b in C.pyrenoidosa,leading to ce
6、ll wall cracked,extravasation and damaged the structure of organelles.PHMB significantly reduced the SOD and GSH-Px activities,and increased the MDA content of C.pyrenoidosa.Moreo-ver,the expression of C.pyrenoidosa photosynthesis-related genes pbsA,rbcL and rbcS significantly upregulated at lowconc
7、entrations of PHMB,and downregulated at high concentrations of PHMB,which reflected a feedback regulation ofPHMB stress response.The study revealed the inhibition of PHMB on the photosynthesis and the growth of C.pyrenoid-osa and provided theoretical basises for PHMB phytotoxic risk assessment.KEY W
8、ORDS:Chlorella pyrenoidosa;polyhexamethylene biguanide;antioxidant enzyme activity;photosynthesis gene聚六亚甲基双胍(polyhexamethylenebiguanide,PH M B)为阳离子聚合物,具有杀菌效果好、不挥发、水溶性好,对温度、光照不敏感,便于储存和运输等优点,因此广泛应用于医疗卫生、日用化工、水产养殖等行业2-3。在水产养殖业中,适量使用PHMB对主要水产经济养殖品种无毒副作用,常用作杀菌消毒剂来防治水产动物疾病的暴发4。但欧洲化学品管理局风险评估委员会已将PHMB认定为可疑
9、致癌物5。同时有研究6-7 表明,以PHMB饲喂小鼠会导致其体重下降或绝食,出现肝细胞溶解和肾收日期:2 0 2 2-0 5-12基金项目:江苏省海洋与渔业科技创新与推广项目(Y2018-24)作者简介:周颖(1996 一),女,江苏兴化人,扬州大学硕士研究生,主要从事养殖水环境研究。*通信作者,魏文志,扬州大学副教授、硕导,主要从事生物饵料与水环境研究;E-mail:w z w e i y z u.e d u.c n。77周颖等:聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究第4期小管损伤,引起动物血液生化指标的改变和海绵状血管瘤发病率的升高,甚至有引起肝癌的风险。随着PHMB在各行业中的大量使
10、用,不可避免地被释放到水环境中,随着水环境中PHMB浓度的不断升高,导致其在水生动植物体内残留,影响水生动物正常生长甚至引起死亡,最终破坏水体生态环境平衡。据俞军等8 报道,PHMG可引起异育银鲫呼吸困难,身体失去平衡,腹部朝上,最后沉人水底死亡。中国对虾受精卵经不同浓度PHMB浸泡后孵化率下降2 0%32%,变态率高达99%9。有研究10)表明高浓度PHMB对球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和亚心形扁藻(Marinemicroalga)的生长有明显的抑制作用,肉眼可见藻液颜色逐渐变淡,按照水生生物毒性分级,PHMB对2 种藻类属于中等毒性。然而,PHMB对许多其他浮游植物的毒
11、性及作用机制尚不明确,函需进一步研究。蛋白核小球藻(Chlorellapyrenidosa)是水生生态系统中最常见的单细胞藻类之一,由于其对污染物的高度敏感性,是研究生态毒理学的经典模式生物11。本试验以蛋白核小球藻为研究对象,探讨蛋白核小球藻在不同时间和浓度PHMB胁迫下的生长状态、叶绿素含量和抗氧化酶活性变化,并探究蛋白核小球藻中光合作用相关基因光合系统基因A(p s b A)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化加氧酶(rbcS)和1,5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶(rbcL)在PHMB胁迫后的表达,为PHMB对水生植物的毒性作用机制研究提供一定的理论依据。1材料与方法1.1供试材料蛋白核小球藻购自中
12、国科学院水生生物研究所淡水藻种库(FACHB-9);聚六亚甲基双胍(PH M B)购自上海高聚生物科技公司(纯度99%),货号为P832584-1g。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);反转录试剂盒、RNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技公司);Goldview核酸染料(北京赛百盛生物科技公司);琼脂糖(北京全式金生物科技公司);DL2000TMDNAMarker、SYBRPr e m i x Ex T a q(日本TaKaRa公司)。1.2试验方法1.2.1试验设计蛋白核小球藻用BG11培养基12 在光照培养箱中进
13、行培养,镜检小球藻细胞形态正常后,取处于对数生长期的蛋白核小球藻,置于10 0 0 mL的锥形瓶中进行PHMB胁迫试验。在半数抑制浓度的基础上,PHMB终浓度设置0(CK)、1(低)、2(中)、4(高)mgL-14个浓度处理,每个浓度设置3个重复。培养条件:温度(2 8 士1),光照度30 0 0 lx,光照周期13h(昼)/11h(夜)。每天定时手动摇晃3次,并及时更换各组位置,以确保每个锥形瓶受到同等的光照度。于PHMB胁迫后0、3、6、9d取小球藻样品进行试验。1.2.2藻细胞密度测定用干燥吸管从锥形瓶中吸取10 0 L藻液,滴于血球计数板中,缓慢放下盖玻片,显微镜下观察并计数1.2.3
14、叶绿素含量测定分光光度法测定小球藻的叶绿素含量13。用量筒量取40 mL藻液,0 下8 0 0 0 rmin-1离心10min,弃去上清,收集藻细胞。超声破碎仪破碎藻细胞,加入8 0%丙酮,混匀后4避光浸提2 4h。用分光光度计于波长6 6 3、6 45、440 nm处检测吸光度,并计算叶绿素含量。叶绿素a含量/mgL-1=12.7D63mm-2.69D645m;叶绿素b含量/mgL-1=22.9D645mm-4.68D663 nm。1.2.4细胞膜通透性测定分别于PHMB胁迫0、3、6、9d时用JENCO3173R电导率仪测定溶液中离子的电导率,以此评桌细胞膜通透性141.2.5酶活性及MD
15、A含量测定按照南京建成试剂盒说明书进行SOD、G SH-Px 活性和MDA含量的测定。薯性78第44卷扬州大学学报(农业生命科学版)1.2.6细胞形态观察1)蛋白核小球藻细胞表面结构观察:取藻液2 0 mL,50 0 0 r min-1离心10 min,2.5%戊二醛固定,4固定过夜,离心,丙酮(30%、50%、7 0%、8 0%、90%、10 0%、10 0%)逐级脱水,醋酸异戊酯置换过夜,真空冷冻干燥2 4h,将冻干的小球藻粉涂抹在导电胶上喷金处理15。在场发射扫描电镜(Gemi-niSEM300)下进行样品的观察和拍照。2)蛋白核小球藻细胞内部结构观察:取藻液2 0 mL,50 0 0
16、r min-1离心10 min,2.5%戊二醛固定过夜,0.1molL-1磷酸盐缓冲液(pH7.0)(PBS)漂洗3次;1%钱酸溶液固定样品1.5h;样品用乙醇梯度脱水,丙酮处理2 0 min;7 0 包埋过夜;超薄切片后柠檬酸铅和醋酸铀双染色16 ;透射电镜(H i t a c h-6 0 0)下进行样品的观察和拍照。1.2.7基因表达分析取50 mL藻液,50 0 0 rmin-离心10 min,弃去上清液,收集藻细胞,使用Trizol一步法进行样品总RNA提取。琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计检测RNA质量和浓度,去基因组反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技公司)进行反转录得到cDNA,以六碱
17、基随机引物合成第1条cDNA;随后加人DNApolymerasel、d NT Ps、RNa s e H 等合成第2 条cDNA。最后用荧光定量PCR检测样品中的基因表达水平,内参基因为18 SrRNAL17。引物合成由上海生工生物工程公司合成,序列如表2 所示。采用2-MCt法定量和分析数据。表1定量引物序列Tab.1Primer sequences for qPCR基因序列(5-3)参考序列geneprimer sequences(5-3)reference sequencepsbAF:GATGGTATCCGTGAGCCTGT;R:TGACAAACGATAAGTTGGTAAGGAEU0430
18、47.2rbcLF:CTTTCCAAGGTCCTCCTCAC;R:TCTCTCCAACGCATAAATGGEU038283.1rbcSF:GGACTACATCGTGAACAACG;R:TCCAGTAGCGGTTGTCGTAGGQ35531118SrRNAF:CGTGCGTAAATCCCGACTTC;R:ACCCTAATCCTCCGTCACCCHQ834484.11.3数据分析试验数据以a士SD表示。采用SPSS17.0软件进行单因素方差(one-wayANOVA)分析,显检验采用Tukeypost-hoctest,处理间Po.05则表示差异显著。2结果与分析2.1PHMB对小球藻生长的影响由图
19、1可见,不同浓度PHMB胁迫对小球藻生长有明显的影响。胁迫9d内,PHMB低、中浓度组小球藻密度较对照组有不同程度的减少,但总体呈现出缓慢上升的趋势(P0.05);PH M B高浓度组小球藻密度与对照组相比呈明显的下降趋势,胁迫9d时,密度降低96.7%(P0.05)。随着PHMB浓度和胁迫时间的增加,蛋白核小球藻生长呈下降趋势,即抑制作用增强,说明PHMB对蛋白核小球藻的生长抑制呈现剂量-效应关系和时间-效应关系。2.2PHMB对蛋白核小球藻叶绿素含量的影响不同浓度PHMB胁迫后,对小球藻叶绿素a含量有明显的影响(图2.A)。胁迫3d时,低、中、高浓度组均显著低于对照组,且不同浓度PHMB组
20、间也存在显著差异,PHMB浓度越高,叶绿素a含量越低。与对照1.2a-01.0-1mgL-1-U901/a2mgL-10.84mgL-1ab0.66工0.4CC工0.2addd00369聚六亚甲基双胍胁迫时间/dpolyhexamethyl biguidine exposure time图1PHMB对小球藻生长的影响Fig.1Effects of polyhexamethyl biguanide(PHMB)on C.pyrenoidosa growth同一时间不同小写字母处理间差异显著(P0.05)。Different letters in the same time represent th
21、e signifi-cantdifferenceofdata(P0.05).79周颖等:聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究第4期组相比,胁迫3d时,低、中、高浓度组叶绿素a含量分别下降11.7 0%、2 9.0 7%和58.6 4%(P0.05);胁迫6 d时,分别下降2 0.19%、39.35%和8 3.8 8%(P0.05);胁迫9d时,分别下降5.32%、45.64%和8 8.6 2%(P0.05)。不同浓度PHMB胁迫后,叶绿素b含量的变化趋势与叶绿素a基本一致(图2.B)。与对照组相比,胁迫3d时,低、中、高浓度组叶绿素b含量分别下降11.7 0%、2 9.0 8%和58.6
22、 5%(P0.05);胁迫6 d时,分别下降2 0.19%、39.35%和8 3.8 8%(P0.05);胁迫9d时,分别下降5.32%、45.6 4%和8 8.6 2%(P0.05)。本试验还观察到高浓度组蛋白核小球藻颜色从初始的翠绿色逐步变成淡绿色,直至变成淡白色。5070AB口0a601 mgL-1401 mg L-1口2 mgL-1a口 2 mg L-1a50D4mgL-1aD4mgL-1b30b40ba30202010100003690369聚六亚甲基双胍暴露时间/d聚六亚甲基双胍暴露时间/dpolyhexamethylbiguidineexposuretimepolyhexamet
23、hyl biguidineexposuretime图2 PHMB对小球藻叶绿素含量的影响*Fig.2Effects of polyhexamethyl biguanide on chlorophyll content in C.pyrenoidosa*同一时间不同小写字母处理间差异显著(P0.05)。*D i f f e r e n t l e t t e r s i n t h e s a m e t i m e r e p r e s e n t t h e s i g n i f i-cantdifferenceof data(Po.05).2.3PHMB对小球藻细胞膜通透性的影响与对照
24、相比,暴露3d时,低、中、高浓度组的电导率分别上升4.98%、9.6 3%、12.11%(P0.05;暴露6 d时,分别上升2.7 8%、7.19%、11.8 3%(P0.05);暴露9d时,分别上升7.6 1%、10.98%、16.2 7%(P0.05)。这说明随着PHMB浓度的增加,小球藻细胞膜通透性逐渐变高(图3)。2.4PHMB胁迫下小球藻细胞形态的观察由蛋白核小球藻藻细胞扫描电镜照片可见,空白对照组藻细胞呈椭圆形,表面完整(图4.A)。不同浓度PHMB胁迫9 d后藻细胞表面呈现出不同程度的损伤,尤其是高浓度组藻细胞表面细胞壁开裂,大量内含物外渗,造成细胞粘连(图4.B一D)。由蛋白核
25、小球藻的透射电子显微镜照片可见,对照组蛋白核小球藻细胞呈广椭圆形,细胞壁厚且完整900口01 mgL-1a850a口2 mgL-1ab4 mgL-1b800Su/率吉申bC750d7006506000369聚六亚甲基双胍暴露时间/dpolyhexamethyl biguidine exposure time图3PHMB对小球藻细胞膜通透性的影响Fig.3Effect of polyhexamethylene biguanid onpermeability of chlorella cell membrane*同一时间不同小写字母处理间差异显著(P0.05)。*Different letters
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