聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究.pdf

版），2 0 2 3，44（4)：7 6-8 3，8 9.引文格式：周颖，魏文志.聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究J.扬州大学学报（农业与生命科学Jul.2023Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2023年7 月Vol.44 No.4第44卷第4期扬州大学学报（农业与生命科学版）D0I:10.16872/ki.1671-4652.2023.04.010聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究周装颖，魏文志（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州2 2 50 0 9）摘要：聚六亚甲基双胍（polyhexamethylene biguanide，PH M B）是一种高分子聚合物杀菌消毒剂，在医药、日用化工和水产养殖等行业广泛应用。为探究PHMB对水生植物的毒性效应，设置0、1、2、4mgL-1浓度的PHMB对蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa）进行O、3、6 和9d的胁迫试验。结果表明：PHMB对蛋白核小球藻的生长具有抑制作用，且随胁迫浓度的升高而增强。PHMB显著降低蛋白核小球藻叶绿素a和b含量，引起藻细胞的细胞壁开裂和内含物外渗，损伤细胞器结构。PHMB显著降低蛋白核小球藻中抗氧化酶超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，并引起丙二醛含量升高。对蛋白核小球藻光合作用相关基因pbsA、r b c L和rbcS的表达检测发现，这些基因在低浓度的PHMB处理后表达升高，而在高浓度的PHMB处理后表达下降，说明小球藻对PHMB胁迫产生反馈调节。综上，PHMB可抑制蛋白核小球藻的光合作用及生长，为PHMB的生态风险评估提供了理论依据。关键词：蛋白核小球藻；聚六亚甲基双胍；抗氧化酶；光合作用基因中图分类号：X171.5文献标志码：A文章编号：16 7 1-46 52（2 0 2 3)0 4-0 0 7 6-0 8Toxic effects of polyhexamethylene biguanide(PHMB)on Chlorella pyrenoidosaZHOU Ying,WEI Wenzhi(College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)ABSTRACT:As a macromolecule polymer disinfectant,polyhexamethylene biguanide(PHMB)is widely used in medi-cine,chemical,aquaculture and other industries.To study the phytotoxic effects of PHMB,Chlorella pyrenoidosa wasexposed to PHMB at 0,1,2 and 4 mg L-1 for 0,3,6 and 9 d,respectivily.The results indicated that PHMB inhibitedthe growth of C.pyrenoidosa and represent in a time-dose effect.Meanwhile PHMB significantly reduced the content ofchlorophyll a and b in C.pyrenoidosa,leading to cell wall cracked,extravasation and damaged the structure of organelles.PHMB significantly reduced the SOD and GSH-Px activities,and increased the MDA content of C.pyrenoidosa.Moreo-ver,the expression of C.pyrenoidosa photosynthesis-related genes pbsA,rbcL and rbcS significantly upregulated at lowconcentrations of PHMB,and downregulated at high concentrations of PHMB,which reflected a feedback regulation ofPHMB stress response.The study revealed the inhibition of PHMB on the photosynthesis and the growth of C.pyrenoid-osa and provided theoretical basises for PHMB phytotoxic risk assessment.KEY WORDS:Chlorella pyrenoidosa;polyhexamethylene biguanide;antioxidant enzyme activity;photosynthesis gene聚六亚甲基双胍（polyhexamethylenebiguanide，PH M B）为阳离子聚合物，具有杀菌效果好、不挥发、水溶性好，对温度、光照不敏感，便于储存和运输等优点，因此广泛应用于医疗卫生、日用化工、水产养殖等行业2-3。在水产养殖业中，适量使用PHMB对主要水产经济养殖品种无毒副作用，常用作杀菌消毒剂来防治水产动物疾病的暴发4。但欧洲化学品管理局风险评估委员会已将PHMB认定为可疑致癌物5。同时有研究6-7 表明，以PHMB饲喂小鼠会导致其体重下降或绝食，出现肝细胞溶解和肾收日期：2 0 2 2-0 5-12基金项目：江苏省海洋与渔业科技创新与推广项目（Y2018-24）作者简介：周颖（1996 一），女，江苏兴化人，扬州大学硕士研究生，主要从事养殖水环境研究。*通信作者，魏文志，扬州大学副教授、硕导，主要从事生物饵料与水环境研究；E-mail：w z w e i y z u.e d u.c n。77周颖等：聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究第4期小管损伤，引起动物血液生化指标的改变和海绵状血管瘤发病率的升高，甚至有引起肝癌的风险。随着PHMB在各行业中的大量使用，不可避免地被释放到水环境中，随着水环境中PHMB浓度的不断升高，导致其在水生动植物体内残留，影响水生动物正常生长甚至引起死亡，最终破坏水体生态环境平衡。据俞军等8 报道，PHMG可引起异育银鲫呼吸困难，身体失去平衡，腹部朝上，最后沉人水底死亡。中国对虾受精卵经不同浓度PHMB浸泡后孵化率下降2 0%32%，变态率高达99%9。有研究10)表明高浓度PHMB对球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）和亚心形扁藻（Marinemicroalga）的生长有明显的抑制作用，肉眼可见藻液颜色逐渐变淡，按照水生生物毒性分级，PHMB对2 种藻类属于中等毒性。然而，PHMB对许多其他浮游植物的毒性及作用机制尚不明确，函需进一步研究。蛋白核小球藻（Chlorellapyrenidosa）是水生生态系统中最常见的单细胞藻类之一，由于其对污染物的高度敏感性，是研究生态毒理学的经典模式生物11。本试验以蛋白核小球藻为研究对象，探讨蛋白核小球藻在不同时间和浓度PHMB胁迫下的生长状态、叶绿素含量和抗氧化酶活性变化，并探究蛋白核小球藻中光合作用相关基因光合系统基因A（p s b A）、核酮糖-1,5-二磷酸羧化加氧酶（rbcS)和1,5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶（rbcL)在PHMB胁迫后的表达，为PHMB对水生植物的毒性作用机制研究提供一定的理论依据。1材料与方法1.1供试材料蛋白核小球藻购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库（FACHB-9）；聚六亚甲基双胍（PH M B)购自上海高聚生物科技公司（纯度99%），货号为P832584-1g。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px)和丙二醛（MDA)检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；反转录试剂盒、RNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技公司）；Goldview核酸染料（北京赛百盛生物科技公司）；琼脂糖（北京全式金生物科技公司）；DL2000TMDNAMarker、SYBRPr e m i x Ex T a q（日本TaKaRa公司）。1.2试验方法1.2.1试验设计蛋白核小球藻用BG11培养基12 在光照培养箱中进行培养，镜检小球藻细胞形态正常后，取处于对数生长期的蛋白核小球藻，置于10 0 0 mL的锥形瓶中进行PHMB胁迫试验。在半数抑制浓度的基础上，PHMB终浓度设置0（CK）、1（低）、2（中）、4（高）mgL-14个浓度处理，每个浓度设置3个重复。培养条件：温度（2 8 士1），光照度30 0 0 lx，光照周期13h（昼）/11h（夜）。每天定时手动摇晃3次，并及时更换各组位置，以确保每个锥形瓶受到同等的光照度。于PHMB胁迫后0、3、6、9d取小球藻样品进行试验。1.2.2藻细胞密度测定用干燥吸管从锥形瓶中吸取10 0 L藻液，滴于血球计数板中，缓慢放下盖玻片，显微镜下观察并计数1.2.3叶绿素含量测定分光光度法测定小球藻的叶绿素含量13。用量筒量取40 mL藻液，0 下8 0 0 0 rmin-1离心10min，弃去上清，收集藻细胞。超声破碎仪破碎藻细胞，加入8 0%丙酮，混匀后4避光浸提2 4h。用分光光度计于波长6 6 3、6 45、440 nm处检测吸光度，并计算叶绿素含量。叶绿素a含量/mgL-1=12.7D63mm-2.69D645m；叶绿素b含量/mgL-1=22.9D645mm-4.68D663 nm。1.2.4细胞膜通透性测定分别于PHMB胁迫0、3、6、9d时用JENCO3173R电导率仪测定溶液中离子的电导率，以此评桌细胞膜通透性141.2.5酶活性及MDA含量测定按照南京建成试剂盒说明书进行SOD、G SH-Px 活性和MDA含量的测定。薯性78第44卷扬州大学学报（农业生命科学版）1.2.6细胞形态观察1）蛋白核小球藻细胞表面结构观察：取藻液2 0 mL，50 0 0 r min-1离心10 min，2.5%戊二醛固定，4固定过夜，离心，丙酮（30%、50%、7 0%、8 0%、90%、10 0%、10 0%）逐级脱水，醋酸异戊酯置换过夜，真空冷冻干燥2 4h，将冻干的小球藻粉涂抹在导电胶上喷金处理15。在场发射扫描电镜（Gemi-niSEM300）下进行样品的观察和拍照。2）蛋白核小球藻细胞内部结构观察：取藻液2 0 mL，50 0 0 r min-1离心10 min，2.5%戊二醛固定过夜，0.1molL-1磷酸盐缓冲液（pH7.0)（PBS)漂洗3次；1%钱酸溶液固定样品1.5h；样品用乙醇梯度脱水，丙酮处理2 0 min；7 0 包埋过夜；超薄切片后柠檬酸铅和醋酸铀双染色16 ；透射电镜（H i t a c h-6 0 0）下进行样品的观察和拍照。1.2.7基因表达分析取50 mL藻液，50 0 0 rmin-离心10 min，弃去上清液，收集藻细胞，使用Trizol一步法进行样品总RNA提取。琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计检测RNA质量和浓度，去基因组反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技公司）进行反转录得到cDNA，以六碱基随机引物合成第1条cDNA；随后加人DNApolymerasel、d NT Ps、RNa s e H 等合成第2 条cDNA。最后用荧光定量PCR检测样品中的基因表达水平，内参基因为18 SrRNAL17。引物合成由上海生工生物工程公司合成，序列如表2 所示。采用2-MCt法定量和分析数据。表1定量引物序列Tab.1Primer sequences for qPCR基因序列（5-3)参考序列geneprimer sequences(5-3)reference sequencepsbAF:GATGGTATCCGTGAGCCTGT;R:TGACAAACGATAAGTTGGTAAGGAEU043047.2rbcLF:CTTTCCAAGGTCCTCCTCAC;R:TCTCTCCAACGCATAAATGGEU038283.1rbcSF:GGACTACATCGTGAACAACG;R:TCCAGTAGCGGTTGTCGTAGGQ35531118SrRNAF:CGTGCGTAAATCCCGACTTC;R:ACCCTAATCCTCCGTCACCCHQ834484.11.3数据分析试验数据以a士SD表示。采用SPSS17.0软件进行单因素方差（one-wayANOVA）分析，显检验采用Tukeypost-hoctest，处理间Po.05则表示差异显著。2结果与分析2.1PHMB对小球藻生长的影响由图1可见，不同浓度PHMB胁迫对小球藻生长有明显的影响。胁迫9d内，PHMB低、中浓度组小球藻密度较对照组有不同程度的减少，但总体呈现出缓慢上升的趋势（P0.05）；PH M B高浓度组小球藻密度与对照组相比呈明显的下降趋势，胁迫9d时，密度降低96.7%（P0.05）。随着PHMB浓度和胁迫时间的增加，蛋白核小球藻生长呈下降趋势，即抑制作用增强，说明PHMB对蛋白核小球藻的生长抑制呈现剂量-效应关系和时间-效应关系。2.2PHMB对蛋白核小球藻叶绿素含量的影响不同浓度PHMB胁迫后，对小球藻叶绿素a含量有明显的影响（图2.A）。胁迫3d时，低、中、高浓度组均显著低于对照组，且不同浓度PHMB组间也存在显著差异，PHMB浓度越高，叶绿素a含量越低。与对照1.2a-01.0-1mgL-1-U901/a2mgL-10.84mgL-1ab0.66工0.4CC工0.2addd00369聚六亚甲基双胍胁迫时间/dpolyhexamethyl biguidine exposure time图1PHMB对小球藻生长的影响Fig.1Effects of polyhexamethyl biguanide(PHMB)on C.pyrenoidosa growth同一时间不同小写字母处理间差异显著（P0.05）。Different letters in the same time represent the signifi-cantdifferenceofdata(P0.05).79周颖等：聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究第4期组相比，胁迫3d时，低、中、高浓度组叶绿素a含量分别下降11.7 0%、2 9.0 7%和58.6 4%（P0.05）；胁迫6 d时，分别下降2 0.19%、39.35%和8 3.8 8%（P0.05）；胁迫9d时，分别下降5.32%、45.64%和8 8.6 2%（P0.05）。不同浓度PHMB胁迫后，叶绿素b含量的变化趋势与叶绿素a基本一致（图2.B)。与对照组相比，胁迫3d时，低、中、高浓度组叶绿素b含量分别下降11.7 0%、2 9.0 8%和58.6 5%（P0.05）；胁迫6 d时，分别下降2 0.19%、39.35%和8 3.8 8%（P0.05）；胁迫9d时，分别下降5.32%、45.6 4%和8 8.6 2%（P0.05）。本试验还观察到高浓度组蛋白核小球藻颜色从初始的翠绿色逐步变成淡绿色，直至变成淡白色。5070AB口0a601 mgL-1401 mg L-1口2 mgL-1a口 2 mg L-1a50D4mgL-1aD4mgL-1b30b40ba30202010100003690369聚六亚甲基双胍暴露时间/d聚六亚甲基双胍暴露时间/dpolyhexamethylbiguidineexposuretimepolyhexamethyl biguidineexposuretime图2 PHMB对小球藻叶绿素含量的影响*Fig.2Effects of polyhexamethyl biguanide on chlorophyll content in C.pyrenoidosa*同一时间不同小写字母处理间差异显著（P0.05）。*D i f f e r e n t l e t t e r s i n t h e s a m e t i m e r e p r e s e n t t h e s i g n i f i-cantdifferenceof data(Po.05).2.3PHMB对小球藻细胞膜通透性的影响与对照相比，暴露3d时，低、中、高浓度组的电导率分别上升4.98%、9.6 3%、12.11%（P0.05；暴露6 d时，分别上升2.7 8%、7.19%、11.8 3%（P0.05）；暴露9d时，分别上升7.6 1%、10.98%、16.2 7%（P0.05)。这说明随着PHMB浓度的增加，小球藻细胞膜通透性逐渐变高（图3）。2.4PHMB胁迫下小球藻细胞形态的观察由蛋白核小球藻藻细胞扫描电镜照片可见，空白对照组藻细胞呈椭圆形，表面完整（图4.A）。不同浓度PHMB胁迫9 d后藻细胞表面呈现出不同程度的损伤，尤其是高浓度组藻细胞表面细胞壁开裂，大量内含物外渗，造成细胞粘连（图4.B一D）。由蛋白核小球藻的透射电子显微镜照片可见，对照组蛋白核小球藻细胞呈广椭圆形，细胞壁厚且完整900口01 mgL-1a850a口2 mgL-1ab4 mgL-1b800Su/率吉申bC750d7006506000369聚六亚甲基双胍暴露时间/dpolyhexamethyl biguidine exposure time图3PHMB对小球藻细胞膜通透性的影响Fig.3Effect of polyhexamethylene biguanid onpermeability of chlorella cell membrane*同一时间不同小写字母处理间差异显著（P0.05）。*Different letters in the same time represent the significantdifference of data(P0.05).细胞核中的核仁与核膜清晰可见；细胞中可见完整的杯状叶色素体，液泡和溶酶体完整（图5.A）。不同浓度PHMB胁迫9d后蛋白核小球藻细胞内部结构发生明显的畸形（图5.B-D）。低浓度组蛋白核小球藻细胞壁增厚，而细胞结构保持较为完整（图5.B)；中浓度组藻体细胞壁松散，细胞核变形，细胞膜结构不完整，可观察到细胞基质的缺失，叶绿体和类囊体的完整性遭到破坏，线粒体变形，线粒体减少，液泡体积和淀粉粒增大（图5.C)；高浓度组蛋白核小球藻细胞呈不规则形状，细胞壁褶皱，色素体和溶酶体萎缩，蛋白核结构被破坏，大量内含物渗出，液泡消失（图5.D）。这说明蛋白核小球藻在高浓度PHMB的持续胁迫下，细胞的表面结构和内部结构均发生明显改变2.5PHMB对小球藻氧化应激的影响不同浓度PHMB胁迫对小球藻SOD活性的影响如图6.A所示。胁迫3d时，与对照组相比，高浓thelvsnsome80第44卷扬州大学学报（农业与生命科学版）CWCWCWEAlumBIumClumDlum图4蛋白核小球藻的扫描电子显微镜（SEM)观察（8 0 0 0）*Fig.4Scanning electron microscope observation of C.pyrenoidosa(X8 000)*A.CK,B.1mgL-1,C.2mgL-1,D.4mgL-l,CW.细胞壁,E.渗出物质。*A.CK,B.1mgL-1,C.2 mg L-1,D.4 mg L-1;CW.cell wall,E.exudate substance.CMCWCWCCMSCWCWSVCCCEPNSSPABCD图5蛋白核小球藻透射电子显微镜（TEM)观察（X23000）*Fig.5Transmission electron microscophs observation of C.pyrenoidosa(X 23 000)*A.CK，B.1m g L-1，C.2 m g L-1，D.4m g L-1；CW。细胞壁，CM.细胞膜，C.色素体，P.蛋白核，N.细胞核，V.液泡，E.渗出物质，S.溶酶体。A.CK，B.1m g L-1，C.2 m g L-1，D.4m g L-1；C Wc e llwall,CM.cell membrane,C.chromatophores,P.protein nucleus,N.nucleus,V.vacuole,E.exudate material,S.度组SOD活性下降2 2.7%（P0.05）。胁迫6、9d时，与对照组相比，各处理组SOD活性下降更加明显，尤其是PHMB胁迫9d时，与对照组相比，中、高浓度组SOD活性分别下降58.6%和7 9.0%（P0.05）。这说明持续高浓度PHMB胁迫会降低蛋白核小球藻的SOD活性。1.0口0 1mgL-1A口2 mgL-14mgL-10.8abaa7b0.6b0.40.200369聚六亚甲基双胍暴露时间/dpolyhexamethyl biguidine exposure time1.2口01 mgL-10.6BC口0 2 mgL-1 4 mgL-1d1.0aaa1 mgL-1aab口 2 mgL-1ab0.80.44mgL-1b0.6Cba0.40.2a0.2003690369聚六亚甲基双胍暴露时间/d聚六亚甲基双胍暴露时间/dpolyhexamethyl biguidineexposuretimepolyhexamethyl biguidineexposuretime图6 PHMB对小球藻抗氧化酶活性的影响*Fig.6Effect of polyhexamethylene biguanide on antioxidant activity in C.pyrenoidosa*同一时间不同小写字母处理间差异显著（P0.05）。*D i f f e r e n t l e t t e r s i n t h e s a m e t i m e r e p r e s e n t t h e s i g n i f i-cant difference of data(P0.05).81周颖等：聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究第4期不同浓度PHMB对小球藻GSH-Px活性的影响如图6.B所示。其变化趋势与SOD类似，随着PHMB胁迫时间的延长和浓度的增高，各处理组GSH-Px活性较对照组均呈下降趋势，且存在显著差异。这说明高浓度PHMB持续胁迫会降低蛋白核小球藻的GSH-Px活性。不同浓度PHMB对小球藻MDA含量的影响如图6.C所示。与对照组相比，随着PHMB胁迫时间的延长，呈现出先增加后下降的趋势，高浓度组下降更加显著。2.6PHMB对小球藻光合作用相关基因表达的影响不同浓度PHMB胁迫下小球藻中光合作用相关基因的表达变化见图7。胁迫3d时，各浓度组psbA基因表达上调,其中高浓度组改变最为显著，其psbA基因的表达量较对照组提高8.0 倍（P0.05）。随着胁迫时间的延长，PHMB对psbA的诱导作用减弱，胁迫9d时，与对照组相比，中、高浓度组psbA基因的表达量分别下降至对照的46.7%和7 8.3%（P0.05）（图7.A）。r b c L基因的表达变化与psbA表达变化趋势相似，在PHMB胁迫3d时显示出较强烈的诱导效应，高浓度组较对照组上升4.0倍（P0.05），胁迫6 d时低浓度组较对照组上升4.0 倍（P0.05），而胁迫9d时，PHMB的诱导效应显著降低（图7.B）。r b c S基因的表达在PHMB的胁迫下，其变化不同于psbA和rbcL，胁迫3d时，中浓度组表达量较对照组上升4.5倍（P0.05）；胁迫6、9d时，除高浓度组外，其他组诱导效应均有减弱趋势(图7.C)。16口0CCA121 mgL-1口 2 mg L-14 mg L-184aa00369聚六亚甲基双胍暴露时间/dpolyhexamethyl biguidine exposure time6b120CB口0CC51mgL-11mgL-1口 2 mgL-194口 2 mgL-14mgL-1b 4 mgL-136abb2abaabaaab3acaa文003690369聚六亚甲基双胍暴露时间/d聚六亚甲基双胍暴露时间/dpolyhexamethyl biguidine exposure timePolyhexamethyl biguidine exposure time图7 PHMB对小球藻光合作用相关基因表达的影响*Fig.7Effect of polyhexamethylene biguanide on the relative expression ofphotosynthesis-related genes in C.p yrenoidosa*同一时间不同小写字母处理间差异显著（P0.05）。*D i f f e r e n t l e t t e r s i n t h e s a m e t i m e r e p r e s e n t t h e s i g n i f i-cant difference of data(P0.05).3讨论PHMB在诸多行业中大量使用，导致其在水环境中广泛分布，给水体生态造成一定的威胁。本试验以蛋白核小球藻为研究对象，用0、1、2、4mgL-1浓度的PHMB胁迫3、6、9d后，对小球藻生长性能、叶绿素含量和抗氧化酶活性均产生明显的影响，蛋白核小球藻中光合作用相关基因表达量也发生明显变化，这进一步加深PHMB对浮游植物毒性的认识。中、高浓度PHMB显著抑制蛋白核小球藻的生长并降低叶绿素含量，细胞膜、细胞器等细胞结构均有明显的皱缩和破损现象，抗氧化酶活性和光合作82第44卷扬州大学学报（农业与生命科学版）用相关基因表达量也有不同程度的改变。在PHMB的胁迫下，蛋白核小球藻的生长性能和表面结构均产生明显的变化。小球藻生长试验显示，不同浓度的PHMB对小球藻的生长有明显的抑制作用，且随着PHMB浓度的增加，抑制作用增强，即具有浓度依赖效应。在扫描电镜下可观察到藻细胞团变小，细胞壁开裂，肉眼可见藻液颜色变淡。这可能是因为PHMB表面带有正电荷，而藻类的细胞颗粒带有负电荷，通过静电吸引作用可使藻细胞形成絮团，并与细胞磷脂化合物结合，导致膜脂结构破坏和膜脂组成改变，从而抑制小球藻生长，导致其死亡17 在PHMB的胁迫下，蛋白核小球藻叶绿素含量变化与其生长指标表现出相似的规律，即随着PHMB浓度的增加，叶绿素含量下降。Ikeda等18 研究发现PHMB能改变细胞膜结构和流动性，进而对细胞器造成破坏。本试验透射电镜观察显示，PHMB同样可破坏小球藻的细胞结构，破坏小球藻的内部蛋白核、叶绿体和类囊体结构等，导致叶绿素合成减少。同时，因小球藻细胞光合作用的能力被抑制，叶绿素含量降低和功能调节紊乱，导致藻体无法维持自身生长需求，使其生长受到抑制。这表明叶绿素含量与小球藻生长密度关系密切，且在受到环境胁迫后两者之间会互相影响。小球藻细胞在长期抵御环境胁迫过程中，进化出抗活性氧（ROS）损伤的保护系统，包括SOD、GSH-Px和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶。在PHMB的胁迫下，SOD和GSH-Px在不同时间段呈现出随PHMB浓度的升高而下降的趋势。Cao等19 研究发现小球藻在聚维酮碘的胁迫下SOD活性降低，这是因为小球藻受到较强的环境胁迫，本试验结果与此类似。GSH-Px以谷胱甘肽（GSH)为底物，催化过氧化氢降解为水2 0 ，本试验中其活性较对照组明显下降，其原因可能是藻体受到PHMB胁迫时，抑制GSH-Px活性2 1。MDA是自由基诱导的脂质过氧化的最终分解产物，MDA含量直接反映ROS在藻类的积累和脂质过氧化程度，是评价膜系统受损程度和藻类抗逆性的重要参数2 2。MDA含量随着PHMB浓度的升高而先升高后降低，表明小球藻遇到有毒物质，其含量因机体发生脂质过氧化而不断增加，而后MDA含量下降，这可能是因为机体细胞膜的破裂，导致MDA释放至胞外水体中。在PHMB的胁迫下，蛋白核小球藻光合作用基因的表达量在不同时间段呈现出先上升后下降的趋势。D1蛋白是光系统II（PSI I）反应中心的重要蛋白，由pbsA基因编码，是高等植物和藻类叶绿体基因组中重要光调控基因2 3。pbsA在PHMB胁迫后呈先上调后下降的趋势，处理前期短时间内的上调可能与藻细胞受到一定程度的应激有关，从而提高PSI活性；但随着PHMB浓度的增加和处理时间的延长，藻细胞自身遭到破坏，其表达量也随之降低。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco)是参与植物光合作用的一种关键酶，它既能转化CO2，又能在光呼吸中催化O2的氧化反应，因此Rubisco对植物的净光合率具有重要影响2 4-2 5。其中I型Rubisco 酶由大亚基(RbcL)和小亚基(RbcS)组成，RbcL具有催化作用，而RbcS发挥调节大亚基 RbcL活性的作用2 6-2 7。在PHMB胁迫下rbcL和rbcS的表达与psbA类似，即短时间（36 d)胁迫显著提高RbcL和RbcS基因的表达量，表明藻体对PHMB毒害的代偿调节状态，而胁迫9d时RbcL和RbcS基因的表达量均明显下降，进一步说明长期的PHMB胁迫使蛋白核小球藻光合作用调节失代偿。庄航等17 研究发现小球藻rbcL、r b c S在乙草胺胁迫下表达量持续降低，光合功能持续下降，最终导致不可逆失活直至死亡，说明PHMB对小球藻光合作用相关基因的表达起着重要的作用。4结论PHMB对蛋白核小球藻有较强的毒性。PHMB抑制蛋白核小球藻的生长，使细胞壁破裂，细胞器遭到破坏，影响蛋白核小球藻叶绿素含量；并在细胞内生成大量的活性氧自由基，致使小球藻抗氧化相关酶失衡；光合作用相关基因pbsA、r b c L和rbcS的表达量在PHMB胁迫下呈先上升后下降趋势，显示出小球藻对PHMB胁迫下的反馈调节作用。这为PHMB对小球藻的毒性效应研究提供了参考，并为PHMB的环境风险评估提供了依据。参考文献：闫华，韩江升，林煦，等聚六亚甲基双胍盐酸盐的性能、应用与合成进展J。山东化工，2 0 17，46（2 0）：83周颖等：聚六亚甲基双胍对蛋白核小球藻的毒性效应研究第4期47-48.YAN H,HAN J S,LIN X,et al.Properties,applications and synthesis of polyhexamethylene biguanide hydro-chloride JJ.Shandong Chemical Industry,2017,46(20):47-48.2陈越英，陈文森，谈智，等.隐形眼镜护理液杀菌效果影响因素研究J.中国消毒学杂志，2 0 11，2 8（2）：142-145.CHENG Y Y,CHENG W S,TAN Z,et al.Study on infencingfactours on germicidal efficacy of contact lens caresolution J.Chinese Journal of Disinfection,2011,28(2):142-145.3崔迎春，乔卫红双胍盐杀菌剂的研究及应用进展J中国洗涤用品工业，2 0 0 9（6）：6 8-7 1.CUI Y C,QIAO W H.Research and application progress of biguanide salt fungicides LJJ.China Cleaning Indus-try,2009(6):68-714崔树玉，陈璐。胍类消毒剂及其研究进展J中国消毒学杂志，2 0 11，2 8（6）：7 49-7 51.CUI S Y,CHENG L.Guanidine disinfectants and their research progress JJ.Chinese Journal of Disinfection,2011,28(6):749-751.5BERNAUER U,BODIN L,CHAUDHRY Q,et al.Opinion of the scientific committee on consumer safety(SCCS)-Final opinion on polyaminopropyl biguanide(PHMB)-Submission II-in cosmetic products JJ.RegulatoryToxicology and Pharmacology,2017,88:328-329.6ASIEDU-GYEKYE I J,MAHMOOD A S,AWORTWE C,et al.Toxicological assessment of polyhexamethylenebiguanide for water treatment JJ.Interdisciplinary Toxicology,2015,8(4):193-202.7APARAJITA C,LORA L A,ZEMIN W,et al.Effect of polyhexamethylene biguanide on rat liver JJ.Toxicolo-gy Letters,2018,285:94-103.8俞军，孙小琪，胡鲲，等。聚六亚甲基双胍对异育银鲫的急性毒性试验J.渔业致富指南，2 0 15（9)：47-49.YU J,SUN Q,HU K,et al.Acute toxicity test of polyhexamethylene biguanide on Carassius auratus JJ.Guideto Getting Rich in Fisheries,2015(9):47-49.9秦志华，李健，刘淇。聚六亚甲基双胍对中国对虾受精卵和无节幼体的影响及其杀菌效果研究J海洋水产研究，2 0 0 6，2 7（5）：39-43.QIN Z H,LIJ,LIU Q.Effects of polyhexamethylene biguanide(PHMB)on zygote and naupli of Fenneropenaeuschinensis and germiciddal efficacy JJ.Marine Fisheries Research,2006,27(5):39-43.10王群，刘淇，李峰，等聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾不同生长阶段及饵料藻类的安全性研究J农业环境科学学报，2 0 0 9，2 8（3）：597-6 0 1.WANG Q,LIU Q,LI F,et al.Security on different growth stages of Litopenaeus vannamei and feeding algae ofpolyhexamethylene biguanide(PHMB)JJ.Journal of Agro-Environment Science,2009,28(3):597-601.11陆洪省，刘亚樵，刘文君，等养殖污水中蛋白核小球藻的分离鉴定及其污水处理效果J农业工程学报，2017,33(4)：2 7 3-2 7 7LU H S,LIU Y Q,LIU W J,et al.Isolation,identification of Chlorella pyrenoides from aquaculture wastewaterand its purification of wastewater J.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering,2017,33(4):273-277.12LUANGPIPAT T,CHISTI Y.Biomass and oil production by Chlorella