块菌活性物质、栽培技术及其在农林生产上的应用.pdf
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1、D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 1-5 3 3 7.2 0 2 3.3.0 9 7*收稿日期:2 0 2 2-0 3-2 9基金项目:国家 林 业 和 草 原 局 林 草 国 家 创 新 联 盟 自 筹 研 发 项 目(G LM 2 0 2 0 0 9);曲 阜 师 范 大 学 重 大 横 向 课 题(k j 2 0 1 9 h x 2 0 1 9 0 0 6,k j 2 0 2 1 h x 0 4 0);江苏省自然科学基金(B K 2 0 1 5 1 2 7 8).第一作者:刘合凤,女,1 9 9 8-,硕士研究生;研究方向:生物学;E-m a i l:1
2、 8 1 7 8 3 2 1 6 8q q.c o m.通信作者:李冠喜,男,1 9 7 0-,教授;研究方向:应用微生物学,食品质量与安全;E-m a i l:g x l i q f n u.e d u.c n.块菌活性物质、栽培技术及其在农林生产上的应用*刘合凤,刘宝宣,孔 勇,李冠喜(曲阜师范大学生命科学学院,2 7 3 1 6 5,曲阜市;山东省栓皮栎产业技术研究院有限公司,2 7 2 0 6 3,山东省济宁市)摘要:文章对块菌的活性成分、半人工栽培技术以及在农林生产上的应用进行了综述,同时,对块菌生产应用中面临的问题展开了讨论和展望,着重分析了相关研究目前面临的主要问题、对策及发展方
3、向.关键词:块菌;活性成分;半人工栽培技术;农林生态效益中图分类号:Q 9 3 5 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1-5 3 3 7(2 0 2 3)0 3-0 0 9 7-0 60 引 言块菌,又名猪拱菌、松露,隶属子囊菌亚门(A s-c o m y c o t i n a)、盘 菌 纲(D i s c o m y c e t e s)、块 菌 科(T u b e r a c e a e),是一类必须和特定植物的根系共生的外生菌根型药食两用地下真菌.块菌的主要发源地和分布区在欧洲的法国、意大利、西班牙,我国块菌的主要产区在云南、四川等地1.目前已知块菌有1 0 0多种,且有新种不断被
4、发现2-3.西方国家对块菌的研究最早可追溯到公元前3 5 0年.1 7 0 1年法国植物学家图尔纳福尔观察到了块菌的子囊孢子.植物学家M i c h e l i于1 7 9 2年首次记载了块菌属(T u b e r),3 1年后,菌物学家F i r e s确认了块菌属在真菌分类学上的地位4-5.1 9 8 5年,刘波对太原块菌(T u b e r t a i y u a n e n s eL i u.)新种的报道标志着国内对块菌属的研究正式开启6.到目前为止,国内外已经对块菌的形态特征、系统分类分布、分子生化、药食价值及种植栽培等多方面进行了研究.近年来,块菌产业显示出良好的市场潜力,但因其产
5、量低、栽培难等问题,制约了块菌的产业发展.因此,本文就块菌的活性成分、半人工栽培技术以及在农林生产上的应用进行了综述,同时,对块菌生产应用中面临的问题展开了讨论和展望,以期为我国农林业更高效地开发利用块菌资源及相关栽培技术的研发提供指导.1 块菌的活性成分已有的研究揭示了块菌中不仅含有多种人体必需的氨基酸、蛋白质、8种维生素和挥发性成分,还含有许多对人体健康有益的生物活性成分,如块菌多糖、a-雄烷醇、神经酰胺、酚类等,并发现了它们作为促进造血、调理月经、抗癌、抗衰老、抗炎及抗糖尿病等药物的潜力7,8.1.1 挥发性物质独特而浓郁的香味是块菌在市场上广受追捧的一个原因.块菌的香气从温和到强烈不等
6、,如鲜松露有大蒜味、灰尘味等,干制松露则会散发出香草味、奶油味等9.对块菌的芳香成分进行研究不仅能解释块菌独特风味的本质,还可以为工业发酵生产块菌中活性成分的研究提供基础理论依据.此外,块菌的芳香成分也是作为块菌物种鉴定的化学标识和衡量块菌品质的重要指标.因此无论是基于其市场价值还是基于其分类价值,块菌芳香成分的研究都很有必要.国外对块菌挥发性成分组成的研究始于2 0世纪5 0年代.1 9 6 7年F i e c c h i等首次研究了白块菌的香气成分,发现了二甲硫基甲烷这一物质1 0.1 9 8 0年黑孢块菌的主要挥发性成分被报道后,大量关于 第4 9卷 第3期2 0 2 3年7月 曲阜师范
7、大学学报J o u r n a l o f Q u f u N o r m a l U n i v e r s i t y V o l.4 9 N o.3J u l y2 0 2 3 块菌菌丝体和子实体的挥发性成分组成的研究陆续在科学杂志上发表.2 0世纪8 0年代时,食品工业用DM S 9(二甲基硫醚)和2-甲基丁醛的混合物来重现黑孢块菌的香气1 1.大量研究数据证实了块菌的特殊香味是由芳香族硫化物、醇类、醛类、酯类等各种挥发物的混合物组成的1 2.迄今为止,从各种块菌中鉴定出的挥发物数量已经超过2 0 0种1 3.虽然不同块菌和同种块菌不同时期所具有的挥发物的种类和数量存在差异,但2-甲基
8、丁醛、3-甲基丁醛、二甲基二硫化物(DMD S)、二甲基硫化物(DM S)是块菌中最常见的天然香气化合物2.在人类能感知到的一小部分气味中,微生物来源的硫挥发物是人类感知块菌香气的关键因素1 4.据M a r y a m等人报道,许多块菌物种所共有的挥发物质可能是块菌和微生物共同产生的,不太常见的挥发物质可能来自单一生产者(酵母、细菌或块菌),而一些罕见的气味物质可能仅由块菌在它们的性阶段合成1 2.国内外对块菌芳香成分的研究主要包括以下几个方面:描述各种松露的挥发物质;探索引起松露香气变化的生物和非生物因素(储存、温度、成熟度等);揭露块菌挥发物与其他生物(植物、昆虫和哺乳动物)间的相互作用
9、;解决松露中的挥发性生物合成问题.按已发表的文献数量,研究各种块菌所含的挥发物种类和研究影响其香气变化的较多,研究后两类的很少1 5.1.2 块菌多糖块菌多糖水溶性好、毒性低、具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、降血糖血脂、抗感染、抗疲劳及防衰老等多种功能,可以应用在医药、保健品、食品和化妆品等多个领域1 6.所以对块菌多糖的研究成为了对块菌活性成分研究的热点之一.1 9 9 4年胡慧娟等1 7首次从中国块菌的子实体中提取出一种新的蛋白结合多糖 块菌多糖,并报导了其对小鼠肿瘤及免疫系统的影响,自此,国内开启了对块菌多糖提取、纯化及生理活性等的研究.在对块菌多糖的研究中,块菌多糖的潜在医药价值堪称“后起
10、之秀”.Z h a o等从5种块菌的子实体或发酵体系中分离出了5 2种多糖,至少对一种体外肿瘤细胞抑制率大于5 0%的多糖组分有1 2个,其中有1 0个来自块菌发酵体系.其实验结果表明块菌发酵系统中的多糖比块菌子实体中的多糖对H e p G 2、A 5 4 9、HC T-1 1 6、S K-B R-3和HL-6 0等肿瘤细胞具有更高的体外抗肿瘤活性1 8.在一定程度上证实了块菌发酵菌丝体作为子实体替代资源的潜力.多项研究都表明了块菌多糖具有抗糖尿病活性,证明了块菌是一种潜在的饮食形式的抗糖尿病药物1 9-2 1.王海燕等采用D E A ES e p h a r o s eF a s tF l
11、o w离子交换层析柱法分离水提醇沉法提取的黑松露多糖,得到2个块菌多糖组分T P 1和T P 2,这2种组分不仅对小鼠巨噬细胞(R AW 2 6 4.7)没有毒性作用,而且都能显 著 增 强R AW 2 6 4.7细 胞 的 中 性 红 吞 噬 能力2 2.L i等从2种中国块菌中分离出了5种多糖,对其中产量最高的2个多糖T P Z-I和T P D-I进行生物测试,结果表明,2种组分均通过介导肠细胞抗氧化防御系统显示出抗氧化特性,可保护培养的肠细胞免受氧化应激诱导的损伤2 3.2 半人工栽培技术低产量,高需求,加之块菌在医药开发和农林生态建设等方面具有较大的应用潜力,由此促生了各国学者对块菌栽
12、培技术的研究热潮.最早欧洲培育块菌的方法有两种:一种是用生长块菌的林地土壤培育橡树幼苗,另一种是将从生长块菌的林地里挖取的天然橡树小苗移植到其他适宜其生长的地方来培育块菌.这两种较原始的培育方式虽然快捷、低成本但也存在着较严重的低效率、易感染等问题.2 0世纪7 0年代,“半人工栽培技术”问世,主要方法是:先人工培养菌根化木苗,再将菌根化的木苗移栽到适合其生长的环境中.法国最早采用该技术实现了黑孢块菌的商业化生产.1 9 9 8年我国台湾宣布成功培育出了台湾块菌1.2 0 0 8年起,中国大陆也可以出产块菌2 4.在过去的半个世纪里,许多科研工作者对从块菌的储存、到菌根苗的培育再到块菌种植园的
13、管理等多方面进行了大量的探索,“半人工栽培技术”得到了较好的发展,目前已经十分成熟,被各国广泛用于块菌的培育.但令人遗憾的是,由于种种原因,块菌栽培技术也仅仅停留在“半人工”水平,至今未实现“纯人工”培育.成熟、白色纹路清晰、香味浓郁的子囊果是孢子悬浮液接种法的首选材料,而未成熟的新鲜块菌子囊果是组织离体培养菌丝的最佳材料2 5.块菌具有广泛的宿主植物,如松树、橡树、栎树、柳树和一些灌木2 6.同种块菌接种不同宿主植物和不同块菌接种同种宿主植物,在菌根的定殖率、形成菌根所需的时间及菌根形态上均有所不同2 7.孢子接种法是最常见、最成熟的一种块菌接种方法.菌丝接种法是89 曲阜师范大学学报(自然
14、科学版)2 0 2 3年在克服孢子接种法成本高的基础上发展起来的,可以长期提供低价的接种源的一种接种方法.该方法首要的就是组织纯培养获得块菌的菌丝体,然后用菌丝来侵染宿主植物的根系,最终形成菌根苗.目前菌丝纯培养的方法主要有组织分离法和菌根分离法,本质都是无性繁殖.李向梅等2 8分别用3种块菌的孢子悬浮液侵染栗树苗,1 0个月后都成功获得了大量外生菌根.苏开美等2 9用黑孢块菌孢子液接种的华山松树苗于第7个月观测到了黄褐色外生菌根.B e n u c c i等同样采用此法接种山核桃幼苗后成功获得菌根化苗木3 0.I o t t i等人于2 0 1 6年在M y-c o r r h i z a上
15、报道成功采用菌丝接种法获得块菌菌根化植物并生产出了子实体3 1.3 块菌在农林生产上的应用菌套(M a n t l e)和哈蒂氏网(H a r t i g n e t)是判断植物根系是否生成外生菌根和鉴定外生菌根种类的重要依据.外生菌根与宿主植物可以形成具有双向作用的共生机制:一方面菌丝可以通过其释放的酶类和有机酸等物质,将有机物含量高的土壤中复杂的有机物分解为简单的无机物,从而提高宿主植物对矿物质的吸收,进而提高宿主植物的营养状况、抗病性和抗逆性等,最终有效促进植物的生长3 2-3 4;另一方面宿主植物光合作用产物会供给块菌菌丝,提供块菌完成生命活动所需要的能量.从投资效益来看,宿主植物把它
16、光合作用积累的物质投入到菌丝的效益明显优于投入到根系上的3 5,3 6.邹捷分别用夏块菌、中华夏块菌、法国黑孢块菌和印度块菌侵染美国山核桃后发现:实验组土壤有机质含量在侵染6个月后显著提高;除印度块菌组外,其它3组土壤有效磷含量都有增加;实验组植株的地上部增长速度快于对照组;植株根系过氧化物酶活性显著高于对照组(表明块菌侵染会影响美国山核桃的光合作用、抗逆性和呼吸作用等生理活动)3 7.这证实了菌根形成可以有效增加植株的株高、根系活力及土壤有机质含量,也揭示了块菌在森林生态效益上的潜力.l v a r e z-L a f u e n t e等证实了块菌侵染能够显著提高甜板栗苗圃的植物性能3 8
17、.B o n e t等讨论了冬青栎和黑松露之间的共生关系及其生态学意义,提议种植黑松露来促进农村重新造林和土地使用稳定3 9.B a j a等首次报道了欧洲松露种植园在沙特阿拉伯半干旱气候中的生长情况4 0,表明了在极端沙漠条件下块菌栽培的可能性,这项工作为适应沙漠气候条件下接种块菌的橡树的可持续栽培开辟了道路.因为块菌喜欢偏碱性的贫瘠土壤环境,所以它在石灰岩地区有着广阔的发展前景.我国恰好有大面积的喀斯特石灰岩山区,在此发展块菌种植业兼具有绿化山川、保护环境和发展特色经济等多重意义.4 块菌生产应用中面临的问题和对策目前,块菌子实体大多来自自然和半人工栽培.块菌自然资源稀缺,半人工栽培通常需
18、要4至1 2年才能收获子实体.并且块菌极易腐烂,即使在冷冻或灭菌等贮藏过程中,松露的香气质量和质地也会发生变化,影响块菌的风味品质.目前块菌在生产应用中主要面临着两大问题.一是优化块菌储存方法和块菌活性物质提取工艺,多方位提高块菌的利用率问题.块菌最简单的储存方法是低温4 保存4 1.没食子酸(GA)是一种潜在的生物控制工具,可以抑制大量的总嗜温细菌,如假单胞菌(致使冷藏黑松露变质的主要破坏细菌之一)在4条件下在块菌子囊果上的生长和繁殖,在冷藏过程中净化和保存新鲜松露4 2.R e a l e等研究表明1.5k G y辐照可以有效延长松露货架期和最大限度减少新鲜松露气味的变化4 3.高C O2
19、在保持块菌香味上似乎也有一定作用4 4.包衣处理能在块菌贮藏期间阻止或延缓松露香气的变化,这有可能在工业上用于延长松露的保质期4 5.清园等的研究表明,以质量保留率下降3%为标准,使用橄榄叶粗提取物(3 0g/L)和壳聚糖(1 5g/L)复配的复合保鲜剂,可以使货架期延长3 6d4 6.随着食品技术的发展,人们期望寻找更多有效的块菌存储方法.以往对松露发酵体系化学成分的研究表明,松露发酵体系中的挥发性有机化合物、脂肪酸等的含量与子实体相似.因此,认为发酵是规模化生产松露菌丝体及其代谢物的一种很有前途的替代方法.T a n g的团队总结了优化松露浸没发酵工艺的策略,揭示出松露的浸没发酵可用于生物
20、质和代谢物的商业生产,有希望成为其子实体的代替品4 7.H s u等的实验结果表明白松露固态发酵得到的菌丝体产品可以替代昂贵的子实体作为抗氧化剂的良好来源4 8.块菌多糖是对其活性成分研究中的热点,研究表明多糖的提取及干燥方法会影响多糖的质量和产量,而且目前对其药理效果的研究集中体现在体外研究上,尤其对块菌的抗氧化活性探讨较多,对块菌在实99第3期 刘合凤,等:块菌活性物质、栽培技术及其在农林生产上的应用 际治疗中的应用的研究有限.未来的研究需要进一步开发块菌的潜在药物价值(如抗抑郁等),优化提取工艺,旨在获得高收率的生物活性化合物的同时,保持甚至提高其原有的活性.此外,需要重点关注它们对不同
21、疾病和病原体的生物测定,以便将这些生物价值有效地纳入块菌衍生的天然产品以及潜在的药物中,使块菌在营养和医学领域得到实际应用.二是如何提高产量的问题.提高块菌的产量是应对市场需求的根本之法.种植园的管理直接影响块菌的质量和产量.然而块菌种植园的管理十分复杂,具体要根据其所处的地理气候条件而定,所以种植园的管理方法更多的需要农林工作者的实践经验.虽然菌丝接种可以长期提供廉价的接种源,是继孢子接种法后的“半人工栽培技术”的又一进步,但是大量的试验发现,菌丝纯培养污染率极高.除了是因块菌组织和菌根自身带有其它菌群以外,不少学者提出了菌丝生长对培养基的营养成分、p H等条件要求较高的观点.于是,如何选择
22、、改良和创新培养基备受关注.I o t t i对黑孢块菌等多种块菌菌丝体 的 分 离 培 养 发 现,最 成 功 的 培 养 基 是mW-PM4 9.A r e n a s优化的MMN培养基提高了菌丝体的生物质产量5 0.林强比较了块菌专用培养基,改良了P D A培养基和M S改良培养基,发现改良的M S培养基上的菌丝萌发生长较快且不易污染,是块菌分离培养较理想的培养基5 1.HM培养基适于印度块菌菌丝体的生长5 2.陈惠群等的研究显示中国块菌菌丝生长的最佳温度为2 32 5,最佳p H为6,作 为 碳 源 双 糖 优 于 单 糖,蛋 白 胨 是 最 佳 氮源5 3.陈应龙表述了不同金属离子对
23、块菌菌丝体生长的影响:C a2+N a+K+M g2+5 4.P a o l aC e c-c a r o l i探索了不同碳水化合物对波氏块菌(T u b e rb o r c h i iV i t t a d.)菌丝体生长的影响5 5.虽然一直在探索,但至今国内对菌丝接种的研究进展没有得到质的飞跃.一方面,培养基的配比及污染率大仍是菌丝纯培养需要解决的首要难题;另一方面,与其它食用菌相比,块菌的菌丝体生长慢,也更容易到达其生长停滞点,所以目前可以对无菌宿主苗木进行菌根接种的研究,但想要直接开展人工化种植的研究还十分困难5 6.因此,在未来的探索中可以将目光偏向影响块菌菌丝生长的因素,发掘菌
24、丝促生因子,优化培养基,摸索人工培育条件下形成块菌子实体的条件.此外,孢子悬浮液侵染宿主植物根系的手段是多样的,且有些目前已经比较成熟,接下来也可以尝试创新更多新方法(比如灌根法).当前,对不同侵染方法效果的比较研究几乎空白,探索最佳侵染手段,也是一个新的研究方向.作为自然资源稀缺的药食两用菌,块菌的市场前景可观,随着对块菌科学研究的推进,块菌的潜在药物价值也不断被发掘,其生态价值也开始被重视.未来应:(1)继续加强块菌的基础研究,如创新延长块菌保鲜期的方法;(2)攻克块菌菌丝接种宿主植物存在的难题;(3)升级块菌加工技术,对块菌的开发积极向生产工业产品靠拢,如抗氧化类化妆品;(4)横向发掘块
25、菌的更多潜在医药功能,纵向加快推进块菌药性的体外试验;(5)更加重视块菌种植带来的附加效益.参考文献:1清源,何晓兰,柳成益,等.名贵地下真菌 块菌的研究进展J.江苏农业科学,2 0 1 3,4 1(1 1):1 9-2 2.2L E EH,NAM K,Z AHR AZ,e t a l.P o t e n t i a l so f t r u f f l e si nn u t r i t i o n a la n d m e d i c i n a la p p l i c a t i o n:Ar e v i e wJ.F u n g a lB i o lB i o t e c h n o
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