基于系统生物学分析探究热应激诱导鸡肠道损伤的作用机制.pdf
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1、4期969基于系统生物学分析探究热应激诱导鸡肠道损伤的作用机制殷斌1,2,3,隽昌宁1,秦雨2,钟诚2,赵增成1,黄中利1,沈涛3,周慧爽4,郑乾坤2*,林树乾1*(1山东省农业科学院家禽研究所,山东济南250023;2得利斯集团有限公司,山东潍坊262216;3山东大学药学院,山东济南250023;4山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018)摘要:【目的】利用系统生物学分析和鸡胚十二指肠上皮细胞模型探究热应激诱导肠道损伤的作用机制,筛选出家禽热应激诱导肠道损伤的作用靶标,为缓解热应激诱导的肠细胞氧化应激提供理论支撑。【方法】基于NCBI数据库筛选热应激诱导肠道损伤的作用靶标,通过GO功
2、能注释和KEGG信号通路富集分析获得相关代谢通路;分离鸡胚十二指肠上皮细胞构建42 热应激模型,通过检测细胞损伤病理、细胞活性、乳酸脱氢酶(LDH)活性、抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)含量及关键基因(Nrf2和HSP70)表达情况等,进一步确认热应激对肠细胞的损伤作用。【结果】将热应激作用靶标与肠道损伤作用靶标取交集,共获得23个热应激诱导肠道损伤的作用靶标,分别是BCL2、CD4、CFTR、ERN1、FOXM1、FOXP3、HMOX1、HSF1、HSP90AA1、HSP70、HSPA4、HSPA8、JUN、MAPK1、MTOR、NFKB1、NLRP3、PLK1、RHOB、SIRT1、SUMO
3、2、TP53和YAP1。KEGG信号通路富集分析发现热应激诱导肠道损伤与NOD-样受体信号通路、沙门氏菌感染、凋亡、细胞衰老及内质网内蛋白加工等有关;GO功能注释分析发现热应激诱导肠损伤与细胞缺氧反应、细胞对镉离子反应、细胞对热反应及热休克蛋白结合等有关。鸡胚十二指肠上皮细胞体外热应激模型验证发现,热应激能导致鸡胚十二指肠上皮细胞空泡变性,严重时则导致细胞核浓缩深染的变性坏死;热应激还会引起鸡胚十二指肠上皮细胞的活性降低,而细胞上清液中的LDH含量升高;此外,随着热应激时间的延长,鸡胚十二指肠上皮细胞内的MDA含量不断上升,而超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化
4、氢酶(CAT)的活性收稿日期:2023-02-24基金项目:山东省自然科学基金项目(ZR2020QC194);山东省科技型中小企业创新能力提升工程项目(2021TSGC1271,2021TS-GC1275,2022TSGC1056)通讯作者:郑乾坤(1975-),https:/orcid.org/0009-0004-4548-8123,高级畜牧师,主要从事肉质产品评价研究工作,E-mail:;林树乾(1979-),https:/orcid.org/0000-0001-7134-022X,博士,副研究员,主要从事新兽药开发研究工作,E-mail:第一作者:殷斌(1988-),https:/orc
5、id.org/0000-0002-4572-7735,博士,主要从事中兽药研发及抗应激药物研究工作,E-mail:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(4):969-981ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.04.001优秀青年学者论坛殷斌(1988-),博士,主要从事中兽药研发及抗应激药物研究工作。主持山东省自然科学基金青年项目“Nrf2-ARE和HSF1-HSE在茶多酚缓解心肌细胞热损伤中的激活和相互作用研究”和山东省科技型中小企业创新能力提
6、升工程项目“防治家禽呼吸道疾病的中兽药制剂研发与技术推广”,作为主要成员参与国家自然科学基金项目3项。在 Cell Stress andChaperones European Journal of Drug Metabolism and PharmacokineticsResearch in Veterinary Science 南方农业学报 等期刊发表学术论文16篇,其中SCI论文9篇;荣获山东省科技进步奖二等奖、齐鲁农学科技奖、中国技术市场金桥奖、中国商业联合会科学技术奖等奖项;以第一完成人获国家发明专利1项,参与获得国家发明专利3项、实用新型专利3项。54卷南 方 农 业 学 报 970
7、均呈下降趋势;热应激导致鸡胚十二指肠上皮细胞内Nrf2基因表达下调、HSP70基因表达上调。【结论】细胞内氧化抗氧化失衡是热应激诱导肠道损伤的重要因素,而热休克蛋白是机体激活细胞抵御热应激损伤的重要保护机制。关键词:鸡;热应激;肠道损伤;氧化损伤;热休克蛋白;系统生物学分析中图分类号:S831.1文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)04-0969-130引言【研究意义】热应激会导致畜禽采食量、生产性能、产品质量及机体免疫力下降,甚至诱发疾病危害,最终导致死亡率增加(宁章勇等,2006;贾先波等,2020)。肠道是营养物质消化吸收的重要场所,也是维持肠道内环境平衡及阻碍致病菌和
8、毒素的先天性屏障。热应激引起的肠道上皮屏障功能受损是造成家禽死亡的重要因素之一(郝贺等,2021)。因此,利用系统生物学分析和鸡胚十二指肠上皮细胞模型探究热应激诱导肠道损伤的作用机制,可为缓解肠道热损伤提供药物治疗的作用靶标。【前人研究进展】热应激是指机体遭受环境温度超过等热区上限的高温度刺激时产生一系列非特异性反应,也称为热应激反应。家禽养殖的等热区温度一般为1027,在全球气候变暖的影响下,越来越多的地区夏季温度逐渐高于等热区温度(Tokarska et al.,Exploring the mechanism of heat stress-induced intestinalinjury
9、in chickens based on systems biology analysisYIN Bin1,2,3,JUAN Chang-ning1,QIN Yu2,ZHONG Cheng2,ZHAO Zeng-cheng1,HUANG Zhong-li1,SHEN Tao3,ZHOU Hui-shuang4,ZHENG Qian-kun2*,LIN Shu-qian1*(1Poultry Research Institute,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan,Shandong 250023,China;2Delisi Group
10、Co.,Ltd.,Weifang,Shandong 262216,China;3School of Pharmaceutical Sciences,ShandongUniversity,Jinan,Shandong 250023,China;4College of Animal Science and Technology,Shandong AgriculturalUniversity,Tai an,Shandong 271018,China)Abstract:【Objective】Based on systems biology analysis and chicken embryo duo
11、denal epithelial cell model,thispaper explored the mechanism of heat stress-induced intestinal injury,to screen the action targets of heat stress-inducedintestinal damage in poultry,and to provide theoretical support for alleviating heat stress-induced oxidative stress inenterocytes.【Method】The NCBI
12、 database was used to screen the action targets of heat stress-induced intestinal injury,and the relevant metabolism pathways were obtained by GO functional annotation and KEGG signaling pathway enrich-ment analysis.Chicken embryo duodenal epithelial cells were separated to construct the heat stress
13、 model at 42.And byusing pathological detection,cell activity,lactate dehydrogenase(LDH)activity,antioxidant enzyme activity,malon-dialdehyde(MDA)content and expression of key genes(Nrf2 and HSP70),the damages of heat stress on intestinal cellswere confirmed.【Result】By taking the intersection of hea
14、t stress action targets and intestinal injury action targets,a totalof 23 action targets of heat stress-induced intestinal injury were obtained,including BCL2,CD4,CFTR,ERN1,FOXM1,FOXP3,HMOX1,HSF1,HSP90AA1,HSP70,HSPA4,HSPA8,JUN,MAPK1,MTOR,NFKB1,NLRP3,PLK1,RHOB,SIRT1,SUMO2,TP53 and YAP1.KEGG signaling
15、 pathway enrichment analysis found that heat stress-induced intestinal injury were associated with NOD-like receptor signaling pathways,salmonella infection,apoptosis,cellular senescence,and protein processing in the endoplasmic reticulum.GO functional annotation analysis found thatheat stress-induc
16、ed intestinal injury were related to cell hypoxia response,cellular response to cadmium ion,cell responseto heat,and heat shock protein binding.The heat stress model of chicken embryo duodenal epithelial cells in vitro showedthat heat stress could cause cells vacuolar degeneration and in severe case
17、s cause nucleus concentrated deep staining thatleading degenerative necrosis;heat stress could reduce cell activity of chicken embryo duodenal epithelial cells andincrease LDH content in cell supernatant;in addition,with the prolongation of heat stress,the MDAcontent in the chickenembryo duodenal ep
18、ithelial cells increased,while the activities of superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px)and catalase(CAT)activities showed a decreasing trend;heat stress resulted in down-regulation of Nrf2 geneand up-regulation of HSP70 gene in chicken embryo duodenal epithelial cells.【Conclusion】I
19、ntracellular oxidative-antioxi-dative imbalance is an important factor in heat stress-induced intestinal injury,and heat shock proteins are important pro-tective mechanism against heat stress-induced injury.Key words:chicken;heat stress;intestinal damage;oxidative damage;heat shock protein;systems b
20、iology analysisFoundation items:Shandong Natural Science Foundation(ZR2020QC194);Shandong Science and TechnologySmall and Medium-sized Enterprises Innovation Ability Improvement Project(2021TSGC1271,2021TSGC1275,2022TSGC1056)4期9712020)。家禽具有羽毛丰厚、皮肤无汗腺、代谢旺盛、体温高等特点,其机体状态和生产性能极易受高温环境的影响(Nienaber and Hah
21、n,2007;Hosseindoustet al.,2020),通常采取通风降温结合湿帘等措施降低鸡舍温度。但在夏季高温时段,降温系统达到的效果温度仍会导致鸡群处于热应激的亚健康状态,即热应激给家禽养殖业造成的危害已不容忽视(Habashy et al.,2017;Goel,2021)。热应激促使机体交感神经兴奋,致使肠胃蠕动能力降低、消化酶分泌能力减弱及消化酶活性下降,导致肠胃排空时间增加,进而导致动物机体食欲减退,影响其生产性能(温静等,2021;朱树庆和王丽娜,2022)。热应激还会破坏肠道屏障的完整性,引起脂多糖(Lipopoly-saccharide,LPS)或菌群泄露,进而引起全身
22、性炎症(宁章勇等,2006;雷昕,2019)。鲍恩东等(2004)研究发现,热应激会导致肉鸡肠道黏膜上皮细胞脱落、黏膜固有层水肿及肠绒毛断裂等病理变化。宁章勇等(2006)通过电镜扫描发现,热应激会导致肉仔鸡十二指肠、空肠、回肠的肠绒毛碎裂甚至出现大面积脱落,肠绒毛出现局部水肿。Mohyuddin等(2022)研究证实,肠道上皮屏障在热应激的病理生理过程中发挥重要作用。热应激诱导肠道损伤的原因主要有:(1)在热应激条件下,由于大量血液流向体表以增加散热,致使流经肠道的血量减少,引起肠道上皮细胞的缺血和缺氧。肠道上皮细胞缺血缺氧则导致机体产生过多的活性氧物质(Reactive oxygen sp
23、ecies,ROS),而ROS会引起细胞内脂质过氧化,造成细胞氧化还原稳态失衡及肠道组织损伤,且其再生能力下降未能及时更新,即肠道是热应激的首要靶器官(Lambert et al.,2002;张瑜等,2021)。(2)热应激会诱导下丘脑垂体轴的激活,导致分泌的皮质酮和促炎因子及诱导下游产生的ROS通过脑肠轴神经元间的连接造成肠道稳态紊乱(Hosseindoust et al.,2022)。(3)热应激引起家禽肠道菌群的失衡,导致包括乳酸杆菌和双歧杆菌在内的有益细菌数量减少,而沙门氏菌和梭状芽胞杆菌等病原菌在肠道中的定殖增加,诱发疾病(Song et al.,2014;Lee et al.,20
24、21)。因此,热应激诱导肠道上皮细胞的过氧化损伤,以及肠黏膜屏障受损造成的肠道内致病菌和内毒素易位,是造成肠道热损伤及家禽死亡的主要原因。【本研究切入点】系统生物学分析是基于大数据生物信息学分析作为工具支撑,以整体理念系统阐明疾病的作用机制,已在抗焦虑、抗抑郁及治疗冠心病上得到应用(黄明峰等,2012;Xu et al.,2013)。近年来,虽有很多学者对热应激诱导肠道损伤进行大量研究(王雪洁和冯京海,2018;余哲琪等,2019;曾怡铭等,2022),但其作用机制尚未明晰,因此亟待通过系统生物学分析探究热应激诱导鸡肠道损伤的作用机制。【拟解决的关键问题】基于系统生物学分析全面阐述热应激诱导肠
25、道损伤的作用机制,并利用鸡胚十二指肠上皮细胞进行体外验证,筛选出家禽热应激诱导肠道损伤的作用靶标,为缓解热应激诱导的肠细胞氧化应激提供理论支撑。1材料与方法1.1试验材料供试SPF鸡胚由山东省农业科学院家禽研究所动物实验中心提供。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;丙二醛(MDA)检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;细胞活性CCK-8检测试剂购自北仁化学科技(北京)有限公司;HE染色所用的苏木素染色液和伊红染色液购自北京索莱宝科技有限公司。1.2肠道损伤相关靶标获取及相互作用网络构建通过
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