基于网络药理学研究复方精油治疗颈肩痛的关键活性成分及透皮吸收性能.pdf
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1、544药品评价 Drug Evaluation 2023,20(5)基于网络药理学研究复方精油治疗颈肩痛的关键活性成分及透皮吸收性能邱晓雨1,金浩鑫2,吴东2,黄文平2,曾文辉3,龚建平1,21.江西中医药大学,江西 南昌 330004;2.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心,江西 南昌 330006;3.江西省药品检查员中心,江西 南昌 330029摘要:目的 探究复方精油(艾叶、没药、乳香、肉桂、干姜、毛冬青精油混合)对颈肩痛的活性成分、作用机制及透皮吸收性能。方法 参照中国药典通则挥发油测定法提取药材的挥发油成分并按比例配制成复方精油,采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)
2、结合文献数据对复方精油成分进行分析鉴定;以网络药理学探究对颈肩痛的作用成分及靶点,采用 Franz 扩散池法考察复方精油的透皮吸收性能。结果 通过 GC-MS 分析结合文献筛选补充得到 77 个主要成分进行网络药理学分析,预测得到其潜在镇痛靶点 46 个;通过网络拓扑筛选获得核心靶点 11 个;KEGG 分析表明复方精油多通路治疗颈肩痛。体外透皮试验结果显示,复方精油中的指标成分桉油精、樟脑、龙脑的 24 h 累计透过量分别为 297.661、811.586、403.128 g/cm2,释放数据均符合零级方程和 Higuchi 方程。结论 复方精油中多种活性成分能够作用于 TRPV1(辣椒素受
3、体)、PTGS2(前列腺素内过氧化物合成酶 2)、IL1B(重组人白介素 1)、TNF(肿瘤坏死因子)等靶点,并通过多通路起治疗颈肩痛作用,透皮吸收具有控缓释效果。关键词:颈肩痛;投药,皮肤;精油;网络药理学;芳香疗法;气相色谱-质谱联用 DOI:10.19939/ki.1672-2809.2023.05.06Active Ingredients and Transdermal Behavior of Mixed Volatile Oils in the Treatment of Neck and Shoulder Pain Based on Network PharmacologyQIU X
4、iaoyu1,JIN Haoxin2,WU Dong2,HUANG Wenping2,ZENG Wenhui3,GONG Jianping1,21.Jiangxi University of Chinese Medicine,Nanchang Jiangxi 330004,China;2.Solid Preparation of Traditional Chinese Medicine Manufacturing Technology National Engineering Center,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,N
5、anchang Jiangxi 330006,China;3.Jiangxi Drug Inspector Center,Nanchang Jiangxi 330029,China.Abstract:Objective To explore active ingredients,mechanism and transdermal behavior of mixed volatile oils on shoulder pain.Methods Extraction of volatile oils according to Chinese Pharmacopoeia,the constituen
6、ts in volatile oil were characterized qualitatively by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),and supplement them by literature data.Exploring the components and targets of action on neck and shoulder pain by network pharmacology.The behavior of mixed volatile oils were investigated by Franz di
7、ffusion cell method.Results Combined with literature data supplement to obtain 77 major components for network pharmacological analysis,46 related targets were predicted,11 core targets were obtained by network topology screening,KEGG analysis shows multiple access to compound essential oils for nec
8、k and shoulder pain.The results of in vitro transdermal tests showed that the 24 h cumulative permeation amounts of eucalyptus oleoresin,camphor and lobster,the index components of the compound essential oil,were 297.661,811.586 and 403.128 g/cm2,respectively,and the release data were in accordance
9、with the zero-level equation and the Higuchi equation.Conclusion The active ingredients in mixed volatile oils regulate multiple signaling pathways to ameliorate inflammation and pain through TPPV1,PTGS2,IL1B,and TNF,transdermal absorption has a controlled slow release effect.Key words:Neck and shou
10、lder pain;Administration,cutaneous;Essential oils;Network pharmacology;Aroma therapy;GC-MS基金项目:江西省重大科技研发专项(20194ABC28009);江西省药品监督管理局科研项目(2022JS31)作者简介:邱晓雨,硕士。研究方向:中药制剂研发。E-mail:xiaoyu_通信作者:龚建平,教授。研究方向:保健食品及功能性食品研发。E-mail:颈肩痛是指颈、肩、肩胛等处的疼痛,伴有一侧或两侧上肢痛、颈脊髓损害症状等,主要源于颈椎病、肩周炎等疾病1。颈肩痛的治疗方式包括手术治疗和非手术治疗2。大多数患
11、者选择非手术治疗,主要分为药物治疗、推拿手法治疗、针灸治疗、牵引治疗等3-6。目前暂无针对颈肩痛的特效药,临床上主要应用消炎镇痛药物如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸等,此类药物可有效镇痛,但长期服用对胃肠道、心血管、神经系统、肝脏、肾脏545药品评价 Drug Evaluation 2023,20(5)等有不良反应7,且随着疼痛加重服药剂量也随之增加。芳香疗法是一种替代疗法,主要使用精油通过推拿按摩的方式进行治疗,可缓解疲劳、疼痛等症状8。中药精油的止痛作用近年来颇受关注,并展现出多种治疗疼痛效果,如痛经、偏头痛、颈椎痛等9,而精油多来源于具有活血化瘀、通经止痛等功效的中药。精油治疗颈肩痛多选用经
12、皮给药的给药方式10。研究发现两种或者多种不同中药精油组合得到的复合中药精油递释系统相较于单一中药精油的生物活性可显著增强11。本实验研究选取包括艾叶、没药、乳香、肉桂、干姜及冬青六种精油组成复方精油,文献12-14报道上述六种精油主要含有成分为 1,8-桉叶素(桉油精)、-姜黄烯、蒎烯、D-莰烯、芳樟醇、肉桂醛等。而研究15表明颈肩痛的发病机制与外周敏化和中枢敏化有关,钾离子、钠离子、5-羟色胺、ATP 等炎性介质激活花生四烯酸通路引发痛敏反应,此外颈肩痛和神经源性炎症也有关系16。“网络药理学”是一门运用网络方法分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的药理分析手段1
13、7。因此,本研究将以网络药理学探究对颈肩痛的作用成分及靶点,并结合气相色谱-质谱(GC-MS)技术鉴定复方精油的化学成分,最后选取指标成分以 Franz 扩散池法考察透皮吸收性能。以期探究复方精油治疗颈肩痛的主要靶点和通路,为深入研究精油经皮给药提供参考。1 材料1.1 动物KM 小鼠,1822 g,雌雄各半,湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号:SCXK(湘)2022-0004。1.2 药材与试剂艾叶(批号 20211106)、乳香(批号 20210405)、没药(批号 20210504)、肉桂(批号 20211009)、干姜(批号 20211211)、冬青(批号 20210608)药材
14、均购于江西一方药业有限公司。乙酸乙酯(中国医药集团有限公司);无水硫酸钠(上海罗恩试剂有限公司);甲醇(中国医药集团有限公司)。对照品:桉油精对照品(批号 110788-201506,含量 98.4%),樟脑对照品(批号 110747-201409,含量 98.7%)购买于中国食品药品研究院。龙脑对照品(批号 DST210312-194,含量 98.0%)购买于成都乐美天医药科技有限公司。1.3 仪器Agilent 7890B-7000D 三重四级杆气相质谱仪,KDM 型控温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器),Agilent 6890N 气相色谱仪,TG328A 十万分之一天平(北京赛多利斯仪器)
15、,TP-6 型智能透皮扩散仪及垂直式 Franz 型扩散池(天津精拓仪器科技),HC-3016R 高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器)。2 方法与结果2.1 挥发油的提取参照 2020 年版中国药典通则 2204 挥发油测定法提取,以得油量为指标单因素考察料液比、浸泡时间、蒸馏时间对提取量的影响,得到最佳提取工艺参数,见表 1。表1 药材最佳提取工艺参数药材料液比浸泡时间/h提取时间/h得油量/mL干姜1001 200251.7乳香100600452.55冬青100800440.18艾叶501 200430.5没药100800357.3肉桂1001 000441.92.2 复方精油的 GC-
16、MS 分析2.2.1 色谱条件 气相条件:分流模式,分流比为21;载 气 流 速,1.0 mL/min;色 谱 柱,Agilent VF-WAXms 30 m250 L0.5 m;程序升温,初始温度40,保持2 min,以3/min升温至180,再以 5 /min 升温至 250,保持 5 min;传输线温度为 260 ;进样量为 1 L;载气为氦气。质谱条件:Scan 全扫描模式;溶剂延迟:3.5 min;离子源温度:230 ;电子能量:70 eV;扫描范围:15650 m/z。2.2.2 GC-MS 分析 GC-MS 测定复方精油中的化学成分,总离子流见图 1。结合文献资料解析,鉴定出化学
17、成分 75 个,占比最高的是桉油精、反式肉桂醛、丁香酚、芳樟醇、-姜黄烯、莪术烯、樟脑、蒈烯、莰烯等。2.3 网络药理学探讨2.3.1 精油成分及颈肩痛靶点筛选 基于 GC-MS定性成分和已发表的文献报道,并通过 TCMSP 数据库、HERB 数据库补充收集复方精油成分。基546药品评价 Drug Evaluation 2023,20(5)于精油的经皮给药特点和里宾斯基五规则,ALogP是反映生物膜之间通透性的主要物理化学参数之一18,以 1ALog P5 为指标,筛选精油的目标活性靶点。以“Cervical Syndrome 颈椎综合征”“Myalgia 肌痛”“Neck Pain 颈部疼痛
18、”“Pain Syndrome Myofascial疼痛综合征肌筋”“Shoulder Pain 肩部疼痛”为颈肩痛相关的疾病关键词,通过挖掘 GeneCards 数据库、OMIM 数据库、Drugbank 数据库、DisGeNET 数据库获取颈肩痛的疾病靶点。结果显示筛选后活性成分共 77 种,导入 Uniprot蛋白质数据库合并删除重复值后共 183 个化合物靶点和 1 126 个疾病靶点。2.3.2 中药精油-成分-靶点网络的构建 将药物疾病交集靶点及成分输入 Cytoscape3.9.1 软件得到网络图,见图 2。图1 复方精油的GC-MS总离子流图图2 中药-活性成分-靶点网络时间/
19、min响应值/mAU547药品评价 Drug Evaluation 2023,20(5)2.3.3 中药精油成分-颈肩痛疾病靶点 PPI 网络构建 将成分靶点与疾病靶点做 Veen 图汇集得到共同靶点 46 个,见图 3。导入 STRING 数据库,将生物种类设定为“Homo sapiens”,得到核心靶点,见图 4。图3 活性成分和疾病靶点的Venn图图4 核心靶点2.3.4 中药精油-颈肩痛疾病靶点功能与通路的富集分析 在 Metascape 的基因面板中导入关键靶点,物种限定设置为“Homo sapiens”,进行 GO 富集分析和KEGG 信号通路富集分析。分析时设置 P0.01,重叠
20、值(Overlap)3,富集值(Enrichment)1.5。分析获得 974 个 GO 功能条目,选取排名前 10的条目绘制 GO 功能分析图,见图 5。在生物过程(biological process,BP)中,涉及对异种刺激的反应,循环系统过程、血液循环、细胞对氮化合物的反应,对细胞外刺激的反应等;在细胞组分(cellular component,CC)中,涉及膜筏、膜微区、质膜筏、小窝突触膜等;在分子功能(molecular function,MF)中,涉及 G 蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素受体活性、金属离子跨膜转运蛋白活性、1-肾上腺素能受体活性等。KEGG 通路富集分析得到化学致癌
21、-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、5-羟色胺能突触、神经活性配体-受体相互作用、cGMP-PKG 信号通路、IL-17 信号通路、TRP 通道的炎症介质调节、胆碱能突触、花生四烯酸代谢、细胞色素 P450 对异生素的代谢、cAMP 信号通路类风湿关节炎等相关信号通路,见图 6。图5 潜在靶点的GO富集分析图6 潜在靶点的KEGG通路富集分析2.4 复方精油 GC 含量测定2.4.1 气相色谱条件 采用 HP-5(0.32 mm30 m 0.25 m)毛细管色谱柱,以氮气为载气,程序升温,初始温度为 90,保持 2 min;以 5 /min 上升到 110 ;再以 10 /min 上升到 150,
22、保持10 min。检测器温度为 250,进样口温度 200,进样量 1 L,分流比为 51。2.4.2 方法学考察 专属性考察:取空白溶剂、供试品透皮接收液和含桉油精 157.792 g/mL、樟脑479.68 g/mL、龙脑 468.48 g/mL 的混合对照品溶548药品评价 Drug Evaluation 2023,20(5)液,按“2.4.1”色谱条件进样检测。结果如图 7 所示,空白溶剂没有干扰测定。A响应值/pA时间/minB时间/min响应值/pAC时间/min响应值/pA图7 色谱图:A.空白溶剂,B.混合对照品溶液,C.供试品透皮接收液 线性考察:精密量取混合对照品溶液,加乙
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