光枝勾儿茶内生真菌多样性及抑菌活性研究.pdf
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1、 .():/.:./.周思旋 张涛 刘畅 等.光枝勾儿茶内生真菌多样性及抑菌活性研究.广西植物():.():.光枝勾儿茶内生真菌多样性及抑菌活性研究周思旋 张 涛 刘 畅 唐远江 卢昱希 杨粤黔 余 波 史开志(.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所 贵阳 .贵州中医药大学 药学院药食两用资源应用与开发研究中心 贵阳 )摘 要:为探索贵州苗药光枝勾儿茶内生真菌类群特征、分布部位及其抑菌活性该研究采用传统方法对贵州省贵阳市和黔西市光枝勾儿茶内生真菌进行分离并基于分子生物学及统计学对其分类地位进行鉴定及多样性评价最后通过微量肉汤倍比稀释法筛选具有抑菌活性的菌株 结果表明:()从光枝勾儿茶中分离到 株内生
2、真菌隶属于 个门 个纲 个目 个科 个属优势属为叶点霉属()、间座壳属()、葡萄座腔菌属()和刺盘孢属()()黔西光枝勾儿茶内生真菌香农维纳多样性指数(.)较贵阳(.)高索伦森相似性指数 为.不同组织香农维纳多样性指数为茎(.)根(.)叶(.)果实(.)茎和叶内生真菌的索伦森相似性最高(.)()筛选出的 株内生真菌对供试菌大肠杆菌()、金黄色葡萄球菌()和沙门氏菌()具有抑菌效果其中 .对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为.、.、.最小杀菌浓度分别为.、.、.以上研究结果揭示了光枝勾儿茶蕴藏丰富的内生真菌资源不同地区及组织内生真菌类群组成有差异多个分离菌株具有抗菌活性为光枝
3、勾儿茶内生真菌天然抗菌药物或药源研发奠定了基础关键词:光枝勾儿茶 内生真菌 多样性 候选菌株 抑菌活性中图分类号:文献标识码:文章编号:().(.):.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金()黔农科院国基后补助(号)第一作者:周思旋()博士副研究员主要从事药用植物微生物资源分类及代谢产物研究().通信作者:史开志研究员主要从事兽药资源开发与产业化研究().:().().(.)(.)().(.)(.)(.)(.).().:.植物内生真菌是指生活在植物细胞中或在其生活史某一时期生活在植物组织内对植物组织没有引起明显病害的一类真菌()几乎所有植物都含内生真菌分布于植物的根、茎、叶、花、果实等各个部位
4、种类和数量繁多每一种植物都是内生真菌潜在的资源宝库()随着内生真菌研究不断深入不同植物的内生真菌组成不同寄主植物的种类、部位、环境和地理区域均是决定内生真菌种群结构的重要因素目前从植物中分离出来的内生真菌种类繁多涉及子囊菌、担子菌、接合菌、无孢菌等多种 类 群(谯 利 军 等 .胡永志等)内生真菌与宿主植物长期协同进化互惠共生处于一种动态平衡的拮抗关系有助于提高宿主对胁迫环境的适应性和抗性在植物生长发育和繁殖中起到了重要作用(隋丽等)有研究表明从植物中分离到的内生真菌能产生丰富的次级代谢产物包括生物碱、苯骈吡喃酮、黄酮、酚酸等多种类型化合物对细菌、真菌、病毒等具有不同程度的拮抗作用在药物研发、
5、病害防治等方面表现出显著的经济价值和应用前景是天然活性物质的重要来源(郭顺星 .)内生真菌的存在及其发挥出来的优越性为寻找结构新颖、活性独特、替代药用植物的新药研发指明了方向光 枝 勾 儿 茶(.)为鼠李科勾儿茶属植物是贵州苗族习用药材味苦、平含苷类、醌类、木脂素类、萜类以及黄酮类等多种化学成分具有抗氧化、抗肿瘤、抗腹泻、抗炎、镇痛、抑菌等活性对治疗支气管炎、痢疾、关节炎等具有良好的效果作为民族药物可用于治疗人、畜肠炎及消化不良性腹泻(梁应林等唐远江等)目前已从该属植物中分离到 个已知化合物和 个蒽醌苯并异色满苯醌二聚体部分化合物显示了较好的对乙酰胆碱酯酶活性体现了明显的研究价值(景永帅等)然
6、而光枝勾儿茶生长周期长产量低易受环境地域等因素影响传统植物开发应用受到了限制其内生真菌作为植物的共生体和一种潜在的新资源在寄主植物提供的营养和保护下经长期共同进化可增强寄主植物的竞争能力和对食草动物、病原体和各种非生物胁迫的抵抗力这种复杂多变的生境使内生真菌在生物制药、农业生产和工业发酵等方面表现出广阔的应用前景是寻找结构新颖、活性独特物质和替代植物的重要来源(元超等)同时内生真菌的开发应用可能实现大规模、低成本和无污染的工业化生产为解决药用植物资源和环境保护提供了新途径 本研究基于光枝勾儿茶的药用价值及植物应用瓶颈解析其内生真菌组成情况设想能够通过筛选植物内生真菌抑菌活性得到具有与植物产生功
7、能相同或相似的次级代谢产物的微生物资源从而部分替代植物来源生产临床天然药物以贵州贵阳、黔西多年生光枝勾儿茶为研究对象系统分离并鉴定根、茎、叶和果实等多个部位的内生真菌在获得可培养真菌资源的基础上采用分子生物学鉴定真菌类群并通过统计学方法对其进行多样性评价分析以大肠杆菌、金黄色葡萄球 期周思旋等:光枝勾儿茶内生真菌多样性及抑菌活性研究菌和沙门氏菌为指示菌筛选具有抑制革兰氏阴性、阳性两类细菌活性的内生真菌类群为研发新型天然抑菌药物提供候选菌株也为光枝勾儿茶进一步开发应用奠定研究基础材料与方法.植物材料分别采集贵州省贵阳市龙洞堡(海拔 )黔西市(海拔 )健康光枝勾儿茶样本 株其中贵阳 株、黔西 株将
8、采集的光枝勾儿茶植株放入采样袋带回实验室 内进行内生真菌分离培养 植株经中山大学植物学廖文波教授鉴定为鼠李科植物光枝勾儿茶(.).测试菌株大肠杆菌()标准株、沙门氏菌()标准株、金黄色葡萄球菌()标准株购自中国微生物菌种保藏中心.内生真菌的分离纯化将采集到的光枝勾儿茶样本冲洗干净并自然晾干用无菌去离子水反复冲洗无菌滤纸吸干水分置于.吐温 溶液中浸泡活化 无菌水冲洗无菌滤纸将水分吸干后于 乙醇中浸泡 无菌水冲洗用无菌滤纸吸干表面水分 采用 乙醇 混合液消毒无菌水冲洗 次无菌滤纸吸干将叶、根、茎和果实剪成小组织块(.)接种于含氯霉素(终浓度为 )的 平板内 恒温培养 为验证表面消毒是否有效将表面消
9、毒组织接种于含氯霉素 培养基上印记同等条件下恒温培养印记部位未见真菌生长则确认消毒彻底(.)随时观察组织块边缘有菌丝长出时采用针尖端菌丝挑取法将菌丝转接于新的 平板直至纯化获得形态均一菌落进行鉴定及保存 分离过程中详细记录组织块及分离菌株数量.内生真菌的鉴定纯化后的菌株参照真菌学鉴定手册(魏景超)从形态学上初步判定菌株分类学地位采用引物/(.)对 基因序列进行扩增及测序 测序成功的 序列通过 分析软件校对、拼接、剪切将剪切后的序列逐一通过 数据库的 进行在线比对鉴定(.)根据序列的相似度和覆盖率结合菌株形态学特征确定各分离菌株归 属 并 根 据 (:/./.)官网查询确认最新的内生真菌分类地位
10、.数据统计及多样性分析通过数据统计根据多样性评价指标采用分离 率()、分 离 频 率()、卡马戈指数()、香农 维 纳 多 样 性 指 数()、辛普森指数()及索伦森相似性指数()分析光枝勾儿茶植物内生真菌的多样性.内生真菌体外抗菌活性筛选.菌株的选择及发酵产物制备根据鉴定结果选择分布于不同属的 株分离菌分别为、和采用 活化待菌丝长满平板后切成小块接种于 培养基于 振荡培养 后静置培养 发酵培养物用等体积乙酸乙酯萃取 次合并萃取液经旋蒸、干燥后加入 培养基稀释至浓度为 的母液备用.菌液制备将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌接种于 固体培养基上划线活化置于 培养 挑取单个菌落于含 液体培养基的
11、试管中置于 、条件下振荡培养 用 液体培养基调整菌液 为.后 稀 释 倍 使 菌 液 浓 度 为 备用.最 小 抑 菌 浓 度()的 测 定 参 考 等()的方法采用微量肉汤二倍稀释法于无菌 孔板每孔中各加入 肉汤培养基分别向第 孔中加入 配备好的药液混匀后依次倍比稀释直到第 孔混匀后弃去 混合液 每孔加入上述配备好的 细菌溶液 每板设置无药和空白对照组观察细菌生长情况 恒温培养 后取出每个浓度做 次重复采用(氯化三苯基四氮唑)法判定 结果 向上述培养 后的 孔板每孔分别加入 .的 避光培养 观察菌液变化情况 试验样本溶液澄清、颜色未发广 西 植 物 卷生变化的最后 孔药物浓度为该药的.最 小
12、 杀 菌 浓 度()的测定 将.试验组澄清的各孔中液体取 涂布于 固体培养基上 培养 观察结果 肉眼观察无菌落生长的最低药物浓度为其 结果与分析.光枝勾儿茶内生真菌组成从贵阳及黔西光枝勾儿茶不同组织部位 个组织块中分离得到 株内生真菌分离率为.(/)其中贵阳分离率为.(/)黔西为.(/)产物序列经校对、拼接、剪切后结合形态学和分子生物学对分离得到的内生真菌进行鉴定(表)结果显示分离菌株隶属于 个门 个纲 个目 个科 个属 在贵阳和黔西分别分离得到 个、个属的菌株 其中仅贵阳分离得到菌株隶属于 个属分别为烟管菌属()、假囊酵 母 属()、毛色二孢属()、歪嘴座壳属()和匍柄霉属()仅黔西分离得到
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