基因编辑技术在现代医学中的应用与挑战.pdf
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1、第 9 卷 第 4 期2023 年 8 月生物化工Biological Chemical EngineeringVol.9 No.4Aug.2023文章编号:2096-0387(2023)04-06基因编辑技术在现代医学中的应用与挑战李香灵,崔安芳,黄延红,马晓磊*(济宁医学院,山东济宁 272067)摘 要:基因编辑技术已经成为现代医学领域中引人注目的工具,其中 RNA 干扰(RNA interference,RNAi)和 CRISPR-Cas9 系统是近年来发展最迅速的基因编辑技术。RNAi 通过介导特定 RNA 分子的降解或抑制来实现基因沉默,而 CRISPR-Cas9 系统可以剪切和编
2、辑特定的 DNA 序列。RNAi 和 CRISPR-Cas9 系统已经在多个领域展示出了巨大的潜力,同时它们在应用中也面临着一些挑战。本文介绍 RNAi 和 CRISPR-Cas9 系统的作用机制,简述了两种基因编辑技术在不同领域的应用,并对其面临的挑战和应用前景进行展望。关键词:RNA 干扰;CRISPR-Cas9 系统;现代医学中图分类号:Q789 文献标识码:CApplicationandChallengesofGeneEditingTechnologyinModernMedicineLI Xiangling,CUI Anfang,HUANG Yanhong,MA Xiaolei*(Ji
3、ning Medical University,Jining 272067,China)Abstract:Gene editing technology has become an attractive tool in the field of modern medicine,among which RNA interference(RNAi)and CRISPR-Cas9 system are the most rapidly developed gene editing technologies in recent years.RNAi achieves gene silencing by
4、 mediating the degradation or inhibition of specific RNA molecules,while the CRISPR-Cas9 system can cut and edit specific DNA sequences.RNAi and CRISPR-Cas9 systems have shown great potential in multiple fields,and they also face some challenges in their applications.This article introduces the mech
5、anism of action of RNAi and CRISPR-Cas9 systems,outlines the applications of the two gene editing technologies in different fields,and makes prospects for the challenges and application prospects they face.Keywords:RNA interference;CRISPR-Cas9 system;modern medicine基因的突变和缺失会干扰正常的代谢途径、细胞周期调节和配体/受体功能,
6、导致许多疾病的发展,而基因编辑技术的出现为这些疾病提供了一种新的解决方案1。在临床上,基因编辑技术已经用于纠正和治疗一些遗传性疾病,如地中海贫血2、高胆固醇血症3、先天性黑蒙症4等,还可以用于治疗艾滋病、癌症和阿尔茨海默病等后天性疾病5-6。但基因编辑技术的临床转化和大规模应用仍处于初级阶段。RNAi 和 CRISPR-Cas9 系统是近年来最具代表性的基因编辑技术。RNA 干扰(RNA interference,RNAi)可以在信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)水平上抑制基因表达,而规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced
7、Short Palindromic Repeats,CRISPR)和其相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)可以方便、高效和精确地切割靶位点的DNA 双链7。本文将对 RNAi 和 CRISPR-Cas9 系统的基因编辑机制进行概述,并介绍 RNAi 和 CRISPR-Cas9 在现代医学中的相关应用和面临的挑战。基金项目:济宁医学院 2020 年度教育教学研究项目(Y2020046)。作者简介:李香灵(1985),女,山东嘉祥人,硕士,讲师,研究方向为肿瘤。通信作者:马晓磊(1981),女,山东潍坊人,博士,副教授,研究方向为肿瘤。E-mail:。第 4 期1
8、89李香灵等:基因编辑技术在现代医学中的应用与挑战1 RNA 干扰技术1.1 原理与机制RNAi 是一种转录后基因调控机制,可以由小干扰 RNA(siRNA)、短发夹 RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)以及其他非编码RNA(如piRNA)触发8。双链 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)可以通过这种机制诱导mRNA的序列特异性降解或抑制mRNA的功能9。如图 1 所示,核糖核酸内切酶 Dicer 通过切割较长的 dsRNA 或 shRNA 产生拥有 21 23 个碱基的成熟的 siRNA10。经加工后,成熟的 siRNA 被整合到包括 Dicer 和 Ago
9、-2 在内的 RNA 诱导沉默复合物(RNA-Induced Silencing Complex,RISC)中11。随后 siRNA 在 RISC 中被分离成正义链和反义链,正义链被释放,而反义链被保留下来通过与靶标的互补结合触发靶标序列被 Ago-2 内切酶切割12。临床治疗中,可以通过直接给予人工制备的 siRNA 来绕过Dicer 介导的形成成熟 siRNA 的初始步骤。图 1 siRNA 作用机制示意图1.2 应用领域自 2018 年第一款 siRNA 药物上市以来,目前已有 5 种 siRNA 药 物(patisiran、givosiran、lumasiran、inclisiran
10、和 vutrisiran)获批3,13-16,还有 58 种 siRNA药物处于临床阶段。siRNA 在癌症治疗和抗病毒等领域同样进展迅速,包括脂质体、脂质纳米粒和抗体在内的各种载体已被用于体内外传递 siRNA17-18。1.2.1 癌症治疗与化疗等传统方法相比,siRNA 介导的抗癌治疗 有以下优点19:(1)特异性高,副作用小;(2)通过级联放大作用进一步沉默靶 mRNA;(3)可以同时抑制多个肿瘤基因;(4)易于合成,生产成本低。目前已有多种 siRNA 抗癌药物进入临床。Atu027是一种被包裹在脂质纳米颗粒中的 siRNA,靶向致癌基因蛋白激酶 N3(Protein Kinase
11、N3,PKN3),临 床试验(NCT00938574)显示其联合吉西他滨对晚期或转移性胰腺癌患者有良好的活性和安全性20-21。siG12D LODER 是一种局部长效 siRNA 递送系统,靶向突变的大鼠肉瘤(RAS)蛋白,I 期临床研究显示其在胰腺癌患者中有良好安全性和有效性22。APN-401 可以减少自体外周血单核细胞中 E3 泛素连接酶(Casitas B-lineage lymphoma proto-oncogene b,Cbl-b)的表达来增强免疫反应,I 期临床研究显示其在癌症患者中诱导了长期的疾病稳定23。1.2.2 抗病毒siRNA 能以高特异性和低毒性的特征沉默靶基因,并
12、且由于 siRNA 序列能被快速设计并合成,使其能适应病毒的各种突变。早期的 RNAi 疗法使用单个 siRNA 序列治疗病毒感染。例如,ALN-RSV01 是一种靶向呼吸道合胞体病毒非结构核衣壳蛋白 mRNA 的单一 siRNA,目前已成功进入 b 期临床试验24。最近的 RNAi 疗法通过使用多个 siRNA 序列来克服病毒的高突变率,防止由于单个靶点突变而引起药物失效18。例如,TKM-130803 由两种等比例的 siRNA 分子组成,以脂质纳米颗粒为载体,通过同时靶向病毒的 siLpol-2 RNA 和siVP35-2 RNA 抑制埃博拉病毒复制25。TENG 等26报道了靶向波恩病
13、毒的 TD-Borna 混合物,通过同时靶向病毒包壳必需的 N-mRNA 和病毒 RNA 合成必需的 L-mRNA 来抑制病毒。2 CRISPR-Cas9 系统2.1 原理与机制CRISPR 系统由单引导 RNA(single guide RNA,sgRNA)和 DNA 内切酶 Cas 蛋白组成,可以在基因组的目标位置引入平末端双链断裂(Double-Stranded Breaks,DSBs)27。如图2所示,CRISPR-Cas9 复合物通过寻找原间隔相邻基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)与 DNA 链接触,随后 CRISPR-Cas9 复合物解190生物化
14、工2023 年开 PAM 序列附近的前 10 12 个核苷酸28-29。如果 sgRNA 的前 8 12 个核苷酸与 DNA 发生互补结合,则 Cas9 中的 HNH 核酸酶结构域和 RuvC 结构域会分别切割初级 DNA 链和次级 DNA 链30修复 DSBs有两种高度保守的机制:非同源末端连接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)途径和同源定向修复(Homology-Directed Repair,HDR)途径31。通过NHEJ 修复的 DNA 通常导致基因被破坏,常用于减少致病基因的过度表达。相反,HDR 可以在存在修复模板的情况下触发,并用于有意纠正基因突变
15、或插入合成序列32。图 2 CRISPR-Cas9 系统作用机制示意图2.2 应用领域目前进入临床的 CRISPR-Cas9 疗法的适应症包括各种遗传疾病。例如,Exagamglogene Autotemcel通过靶向血红蛋白来改善地中海贫血,目前已经申请上市2。AGN-151587 通过调节 Cep290 基因治疗先天性黑蒙症,目前处于临床期4。同时 CRISPR-Cas9 系统在癌症、病毒感染等领域的研究也发展迅速33。绝大多数 CRISPR-Cas9 临床试验都从患者身上提取特定细胞,进行富集和基因编辑,然后重新引入患者体内,这有助于提高基因编辑效率并降低药物毒性。除了离体方法,CRIS
16、PR-Cas9 也可以通过载体进行体内基因编辑。2.2.1 癌症CRISPR-Cas9 技术在癌症治疗中的应用,一方面是产生嵌合抗原受体 T(Chimeric Antigen Receptor-T,CAR-T)细胞,通过收集患者 T 细胞并进行 CRISPR-Cas9 基因编辑,达到在体外攻击癌症抗原的目的,然后将这些细胞转移回患者体内。OTTAVIANO 等34使用CRISPR-Cas9 系统敲除了 CAR19 T 细胞的 T 细胞受体 恒定区(T Cell Receptor Alpha Constant,TRAC)和 分 化 簇 52(Cluster of Differentiation
17、52,CD52),在 I 期临床实验中对儿童 B 细胞急性淋巴细胞白血病有一定疗效。GIUFFRIDA 等35报道了 CRISPR-Cas9 介导的腺苷 2A 受体缺失增强了嵌合抗原受体 T 细 胞(Chimeric AntigenReceptor T-cell,CAR-T细胞)效应功能,在临床前模型中显示出良好的疗效。另一方面,CRISPR-Cas9 也可用于取代主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)等位基因。MEISSNER 等36-37使用 CRISPR-Cas9 敲除 CD4+T 细胞中的 2-微球蛋白(beta-2-micro
18、globulin,B2M)基因,导致MHC-I表面表达丧失,从而产生大量可转移的 T 细胞,显示出强大的抗白血病功能。CROWTHER 等38通过 CRISPR-Cas9 系统敲除 MHC-I 类相关蛋白 MR1,确认其在多种癌症上表达,并可以被 T 细胞靶向,为癌症治疗提供新的思路。CRISPR-Cas9 还可以编辑干细胞和免疫应答细胞中的基因。例如,程序性死亡受体 1(Programmed Cell Death Protein 1,PD-1)可以被 CRISPR-Cas9 技术靶向并敲除,该技术对肝癌(NCT04417764)、肺癌(NCT02793856)和前列腺癌症(NCT035256
19、52)的临床试验正在进行中39。2.2.2 抗病毒CRISPR-Cas9 系统可以特异性靶向和破坏病毒的基因。TIAN 等40计划通过 CRISPR-Cas9 敲除 HPV病毒 E6 和 E7 基因来治疗 HPV 相关的宫颈上皮内瘤 变(NCT03057912)。SEEGER 等41证明 CRISPR-Cas9 系统可以特异性地破坏乙型肝炎病毒中的共价闭合环形 DNA(covalenr closed circular DNA,cccDNA)以达到治疗效果。WANG 等42证明 CRISPR-Cas9 可以抑制人类疱疹病毒 4 型(Epstein-Barr virus,EBV)基因的表达,通过在
20、病毒感染的潜伏期精确靶向病毒基因组来减少感染。WOLLEBO 等43证明通过 CRISPR-Cas9 可以在转化的人类神经胶质细胞中灭活编码 T抗原的基因并抑制多瘤病毒 JC 的复制。3 RNAi 与 CRISPR-Cas9 系统的应用挑战尽管 RNAi 和 CRISPR-Cas9 相关疗法的开发在第 4 期191李香灵等:基因编辑技术在现代医学中的应用与挑战过去十年中进展迅速,但组织靶向递送困难和脱靶效应仍较大地限制了其临床应用,因此提高药物传递效率和特异性是未来主要的研究方向。3.1 传递效率裸露或未修饰的 siRNA 以及 CRISPR-Cas9 系统容易被人体各种酶降解,导致传递效率低
21、下,因此需要寻找高效的载体。纳米载体是递送 siRNA 的常用载体,可以保护 siRNA 免受核酸酶降解,促进细胞对siRNA 的摄取。但纳米颗粒的稳定性差,并且在肿瘤组织中分布不均匀。病毒载体(例如腺病毒)是递送CRISPR-Cas9 最全面的载体,具有致癌风险低、免疫原性低等优势,但可能会增加药物脱靶效应44。而非病毒递送(如纳米颗粒)可以更精确地控制给药的剂量和时间,降低脱靶效应和潜在副作用,但也存在整体尺寸大导致递送困难,编辑效率低等问题46。因此研究人员需要寻找适合的递送系统,以提高基因编辑工具的传递效率。3.2 特异性RNAi 与 CRISPR-Cas9 系统的另一个挑战是特异性。
22、siRNA 分子可能发生脱靶沉默,从而导致基因发生有害突变。研究表明,脱靶沉默的原因是 siRNA有 6 7 个核苷酸与脱靶基因存在同源性46-47。而CRISPR-Cas9 技术经常在不需要的基因组位点造成片段基因的插入或缺失,导致基因突变并产生毒性。KLEINSTIVER 等48的研究表明,可以通过修饰 Cas9蛋白以改变候选识别位点的毗邻基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)偏好或增强对靶 DNA 的识别,这可以降低脱靶效应的频率,如有研究人员通过设计新 Cas 酶来优化基因编辑特异性49-51。4 展望RNAi 作为一种精确调控基因表达的工具,可以实现特定
23、基因沉默,在基因治疗、癌症治疗、遗传病治疗等领域具有广泛的应用。然而,RNAi 仍面临传递效率和特异性的挑战,需要开发更有效的递送系统和更稳定的RNA 分子,以提高传递效率和特异性。CRISPR-Cas9 系统为编辑基因组提供了强大的工具,并在基因功能研究和疾病治疗中展示出巨大的应用前景。然而,CRISPR-Cas9 系统精确性和安全性需要进一步改进和评估,以减少非特异性基因编辑和潜在的副作用。RNAi 和 CRISPR-Cas9 系统在医学研究和临床实践中的应用领域需要进一步拓展。除了目前研究较多的抗癌和抗病毒领域,未来的研究可以探索这些技术在神经退行性疾病、免疫系统疾病、传染病等更多领域的
24、潜在应用。此外,结合 RNAi 和 CRISPR-Cas9系统,可以开发出更多种类的组合治疗策略,以提高疗效并克服单一疗法的局限性。参考文献1 SAYED N,ALLAWADHI P,KHURANA A,et al.Gene therapy:comprehensive overview and therapeutic applications J.Life Sci,2022,294:120375.2 LANGER A L,ESRICK E B.-Thalassemia:evolving treatment options beyond transfusion and iron chelatio
25、n J.Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2021,2021(1):600-606.3 LAMB Y N.Inclisiran:first approval J.Drugs,2021,81(3):389-395.4 MAEDER M L,STEFANIDAKIS M,WILSON C J,et al.Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10 J.Nat Med,2019,25(2):229-23
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