过表达叉头盒F1对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响及机制实验研究.pdf
《过表达叉头盒F1对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响及机制实验研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《过表达叉头盒F1对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响及机制实验研究.pdf(5页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、2 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(2 0 2 0 J M-0 7 4)通讯作者:李仕伟,E-m a i l:4 6 3 4 1 8 4 0 4q q.c o m过表达叉头盒F 1对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响及机制实验研究陈 萍1,马小平2,蔡 爽2,贾浴侦2,李仕伟2(1.天水市第一人民医院老年病科,甘肃 天水7 4 1 0 0 0;2.西安交通大学医学部基础医学院细胞生物学与遗传学系,陕西
2、西安7 1 0 0 6 1)摘 要 目的:探讨过表达叉头盒F 1(F O X F 1)对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响,并初步探究其分子机制。方法:选取肝癌细胞(MHC C-9 7 H和H u h 7细胞)为实验细胞,分别设立v e c t o r组(转染空白载体)和o v-F O X F 1组(转染F O X F 1过表达载体)。采用实时荧光定量P C R(R T-q P C R)和W e s t e r nb o l t检测转染后F O X F 1mR NA及蛋白表达。采用MT T法检测肝癌细胞增殖。采用流式细胞术检测肝癌细胞周期和细胞凋亡。采用W e s t e r nb o l t检测
3、W n t 5 a/-c a t e n i n信号通路相关蛋白表达。结果:o v-F OX F 1组H u h 7和MHC C-9 7 H细胞F OX F 1mR NA和蛋白表达量高于v e c t o r组(均P0.0 5)。转染后4 8、7 2h,o v-F O X F 1组H u h 7和MHC C-9 7 H细胞增殖受到抑制(均P0.0 5)。与v e c t o r组比较,o v-F O X F 1组H u h 7和MHC C-9 7 H细胞G0/G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低(均P0.0 5)。o v-F O X F 1组G2/M期H u h 7细胞比例较v e c t o
4、 r组降低(P0.0 5)。o v-F O X F 1组H u h 7和MHC C-9 7 H细胞凋亡比例高于v e c t o r组(均P0.0 5)。与v e c t o r组比较,o v-F OX F 1组F O X F 1、a c t i v eC a s p a s e-3蛋白表达增加,W n t 5 a、-c a t e n i n、c-m y c、细胞周期蛋白D 1(C y c l i nD 1)蛋白表达降低(均P0.0 5)。结论:F OX F 1过表达能够抑制肝癌细胞的增殖及周期进展,促进细胞凋亡,其机制可能与调控Wn t 5 a/-c a t e n i n通路及细胞周期相
5、关蛋白等有关。关键词 肝癌细胞;叉头盒F 1;细胞增殖;细胞凋亡;细胞周期;W n t 5 a/-c a t e n i n通路中图分类号:R7 3 5.7 文献标志码:A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 0-7 3 7 7.2 0 2 3.0 9.0 0 7E f f e c t so fF O X F 1o v e r e x p r e s s i o no np r o l i f e r a t i o n,c y c l ea n da p o p t o s i so fh e p a t o c e l l u l a r c a r c i
6、 n o m ac e l l sa n d i t sm e c h a n i s mCHE NP i n g,MAX i a o p i n g,C A IS h u a n g,J I AY u z h e n,L IS h i w e i(D e p a r t m e n to fG e r i a t r i c s,t h eF i r s tP e o p l esH o s p i t a l o fT i a n s h u i,T i a n s h u i 7 4 1 0 0 0,C h i n a)A B S T R A C T O b j e c t i v e:
7、T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so f f o r k h e a db o xF 1(F OX F 1)o v e r e x p r e s s i o no nt h ep r o l i f e r a-t i o n,c y c l ea n da p o p t o s i so fh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m ac e l l s,a n dt oe x p l o r e i t sm o l e c u l a rm e c h a n i s m.M e t h o
8、 d s:H e p a t o-c e l l u l a r c a r c i n o m ac e l l s(MHC C-9 7 Ha n dH u h 7c e l l s)w e r es e l e c t e da se x p e r i m e n t a l c e l l s,a n dv e c t o rg r o u p(t r a n s-f e c t e dw i t hb l a n kv e c t o r)a n do v-F OX F 1g r o u p(t r a n s f e c t e dw i t hF O X F 1o v e r e
9、 x p r e s s i o nv e c t o r)w e r e s e t u p,r e s p e c-t i v e l y.R T-q P C Ra n dW e s t e r nb l o tw e r eu s e dt od e t e c t t h ee x p r e s s i o n so fF OX F 1mR NAa n dp r o t e i na f t e r t r a n s f e c-t i o n.T h ep r o l i f e r a t i o no fh e p a t o c e l l u l a r c a r c
10、i n o m ac e l l sw a sd e t e c t e db yMT Ta s s a y.T h ec e l l c y c l ea n da p o p t o s i so fh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m ac e l l sw e r ed e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r y.W e s t e r nb l o tw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fW n t 5 a/-c a t e n
11、i ns i g n a l i n gp a t h w a y-r e l a t e dp r o t e i n s.R e s u l t s:T h ee x p r e s s i o n so fF O X F 1mR NAa n dp r o t e i n i nH u h 7a n dMHC C-9 7 Hc e l l s i no v-F OX F 1g r o u pw e r eh i g h e r t h a nt h o s e i nv e c t o rg r o u p(a l lP0.0 5).A t 4 8a n d7 2h o u r sa f
12、t e r t r a n s f e c t i o n,t h ep r o l i f e r a t i o no fH u h 7a n d MHC C-9 7 H c e l l si no v-F O X F 1g r o u pw a si n h i b i t e d(b o t hP0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h ev e c t o rg r o u p,t h ep r o p o r t i o no fG1/G0p h a s ec e l l s i nH u h 7a n dMHC C-9 7 Hc e l l si no v
13、-F O X F 1g r o u p i n c r e a s e d,a n dt h ep r o p o r t i o no fSp h a s ec e l l sd e c r e a s e d(a l lP0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h ev e c t o rg r o u p,t h eo v-F O X F 1g r o u ph a da s i g n i f i c a n t l y l o w e rp r o p o r t i o no fH u h 7c e l l s i nG2/Mp h a s e(P0.0 5)
14、.T h ea p o p t o s i sr a t eo fH u h 7a n dMHC C-9 7 Hc e l l s i no v-F O X F 1g r o u pw a sh i g h e r t h a nt h a t i nv e c t o rg r o u p(b o t hP0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h ev e c t o r g r o u p,t h e e x p r e s s i o n so fF O X F 1a n da c t i v eC a s p a s e-3p r o t e i n s i n
15、 t h eo v-F O X F 1g r o u pw e r e i n c r e a s e d,a n dt h ee x p r e s s i o n so fW n t 5 a,-c a t e n i n,c-m y ca n dC y c l i nD 1p r o t e i n sw e r ed e c r e a s e d(a l lP0.0 5).C o n c l u s i o n:T h eo v e r e x p r e s s i o no fF OX F 1c a n i n h i b i t t h ep r o l i f e r a t
16、i o na n dc y c l ep r o g r e s s i o no fh e p a-t o c e l l u l a r c a r c i n o m ac e l l s,a n dp r o m o t ec e l l a p o p t o s i s.T h em e c h a n i s m m a yb er e l a t e dt ot h er e g u l a t i o no fW n t 5 a/-5411陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l2 0 2 3年9月第5 2卷第9期
17、S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9c a t e n i np a t h w a ya n dc e l l c y c l e-r e l a t e dp r o t e i n s.K E Y WO R D S H e p a t o m ac a r c i n o m ac e l l;F o r k h e a db o xF 1;C e l lp r o l i f e r a t i o n;C e l la p o p t o s i s;C e l lc y c l e;W n t 5 a/-c a t e n i np a t h w a y 肝癌的
18、发病率和病死率较高,其发生受到多种内外在因素的影响,包括肝硬化、年龄、性别、饮食习惯、遗传因素等1。肝癌的发生涉及分子、细胞以及组织等多个层面的改变,包括细胞微环境改变、变异细胞免疫逃避增强等进而发展为癌组织。有研究2发现,约8 0%的癌细胞存在启动子、调节基因、病毒插入、染色体变异和端粒酶改变等基因改变。叉头盒(F o r k h e a db o x,F O X)家族蛋白是D NA结合蛋白,具有调节、转录和修复D NA的功能,参与细胞生长、分化,且与胚胎发生有关3。近年来,F O X家族基因变异相关研究发现,其在癌症发展中具有重要作用。其中,F O X A 1过表达与肺癌、食管癌、乳腺癌、
19、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤以及胰腺癌等有关;F O X O 1基因在前列腺癌中缺失,在尤文氏肉 瘤 中 表 现 为 下 调4-7。研 究 发 现,乳 腺 癌 中F O X F 1启动子高甲基化,结直肠癌中F O X F 1异位表达,甲状腺癌中F O X F 1表达下降。因此,F O X F 1与癌症关系密切,但其与肝癌的关系相关研究较少,故本研究探讨F O X F 1对肝癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其作用机制。1 材料与方法1.1 实验细胞 人源肝癌细胞系MHC C-9 7 H细胞购自上海弘顺生物科技有限公司,人源肝癌细胞系H u h 7细胞购自大连美仑生物技术有限公司,培
20、养环境为5%C O2、3 7。1.2 主 要 试 剂 甲 基 噻 唑 基 四 唑(MT T,批 号:M 0 8 9 4)、R I P A裂解液(批号:C K 5 3 9 7 6)购自S i g m a公司;辣根过氧化物酶(HR P)标记羊抗鼠二抗(批号:2 1 C 4 8 2 4)购自K P L公司;鼠抗人F O X F 1抗体(批号:2 1 0 3 4 6 7 8)、鼠抗人-c a t e n i n抗体(批号:3 5 R 6 8 9 2 4)、鼠抗人Wn t 5 a抗体(批号:2 1 R 8 5 2 1 4)、抗GA P DH抗体(批 号:2 1 9 8 3 8 4)购 自S a n t
21、aC r u z公 司;A n n e x i nV-F I T C凋亡试剂(批号:F X 6 7 2 9 3 4)购自B DB i o s c i-e n c e公司;细胞周期蛋白D 1(C y c l i nD 1)抗体(批号:2 1 0 9 8 6 4 9)购自A b c a m公司。1.3 实验方法1.3.1 实验分组:MHC C-9 7 H细胞和H u h 7细胞分别设立v e c t o r组(转染空白载体)和o v-F O X F 1组(转染F O X F 1过表达载体)。1.3.2 F O X F 1过表达载体构建及转染:获取扩增后目的基因m i c r o R NA(m i
22、R NA),插入空载体后转入大肠杆菌培养,鉴定目的基因。将空白载体、F O X F 1过表 达 载 体 提 取 后 转 染,根 据 转 染 试 剂 说 明 书 将MHC C-9 7 H细胞和H u h 7细胞分别接种于9 6孔板中,培养过夜,然后加入载体及相关试剂,分别在2 4、4 8、7 2h进行相关检测。1.3.3 实时荧光定量P C R(R T-q P C R)和W e s t e r nb o l t检测转染后F O X F 1 mR NA及蛋白表达:转染4 8h后收集各组细胞,分别加入氯仿和异丙醇提取R NA。根 据P C R扩 增 试 剂 说 明 书 检 测F O X F 1mR
23、NA表达量。F O X F 1正向引物序列为5-AT A-AA C T C AGAT T G GAA C A C AG-3,反向引物序列为5-G T A C T C T AAG C T T C C T G G C A-3。采用R I P A裂解液提取细胞蛋白,进行电泳,转膜,室温封闭1h后,分别加入鼠抗人F O X F 1单克隆抗体(11 0 0 0稀释)、鼠抗人GA P DH单克隆抗体(11 0 0 0稀释),4孵育过夜,洗膜。加入HR P标记的羊抗鼠二抗(12 0 0 0稀释)室温孵育2h,洗膜。加入E C L化学发光底物,应用S y n g e n eGB o x系统拍照及分析。1.3.
24、4 MT T检测肝癌细胞增殖:在转染后的第1、2、3天,每天取5孔按MT T试剂说明书加入MT T试剂,继续培养4h,弃去上清,加入DM S O后上机检测。1.3.5 流式细胞术检测肝癌细胞周期:转染4 8h后收集各组细胞,无水乙醇4固定过夜。根据试剂说明书加入核糖核酸酶A(R N a s e A)、碘化丙啶(P I)染液等试剂后孵育。流式细胞仪检测染色后细胞,记录不同细胞周期所占比例。1.3.6 流式细胞术检测肝癌细胞凋亡:转染4 8h以后,收集各组细胞,制备成单细胞悬液,细胞浓度为1 5 0 0 0个/m l。根据试剂说明书加入A n n e x i nV-F I T C和P I,孵育1
25、5m i n。流式细胞仪检测染色后的细胞,记录凋亡细胞比例。1.3.7 W e s t e r nb o l t检测Wn t 5 a/-c a t e n i n信号通路蛋白表达:转染4 8h后收集各组细胞,采用R I P A裂解液提取细胞蛋白,进行电泳、转膜。室温封闭1h后,分别加入鼠抗人F O X F 1单克隆抗体(11 0 0 0稀释)、鼠抗人Wn t 5 a/-c a t e n i n途 径相关蛋白 单克隆抗体(11 0 0 0稀 释)、鼠 抗 人-a c t i n单 克 隆 抗 体(13 0 0 0稀释)以及其他相关抗体,4 孵育过夜,洗膜。用HR P标记的羊抗鼠二抗(12 0
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 表达 叉头盒 F1 肝癌 细胞 增殖 周期 影响 机制 实验 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。