槲皮素阻滞JAK2_STAT3信号通路对软骨肉瘤细胞迁移、侵袭和EMT的抑制作用研究.pdf
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1、激光生物学报ACTALASERBIOLOGYSINICAVol.32 No.3June.2023第 32 卷第 3 期2023 年 6 月收稿日期:2023-03-20;修回日期:2023-04-07。作者简介:李毅,主治医师,主要从事骨外科相关疾病诊疗的研究。*通信作者:赵维彪,主任医师,主要从事骨外科相关疾病诊疗的研究。E-mail:。槲皮素阻滞JAK2/STAT3信号通路对软骨肉瘤细胞 迁移、侵袭和EMT的抑制作用研究李毅1,张恒2,赵维彪1*(1.辽宁省金秋医院骨外科,沈阳 110016;2.中国医科大学附属第一医院病理科,沈阳 110001)摘要:为探究槲皮素对人软骨肉瘤细胞迁移、侵
2、袭和上皮间质转化(EMT)的影响及对Janus激酶2/信号转导和转录启动因子3(JAK2/STAT3)信号通路的调控作用,体外培养人软骨肉瘤SW-1353细胞,用不同浓度槲皮素干预SW-1353细胞24 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)法筛选出最适浓度(50.0 mol/L)槲皮素进行后续试验。将细胞分为对照组(不做干预)、槲皮素组(50.0 mol/L槲皮素)、阳性药物组(6.0 mol/L阿霉素)、抑制剂组(50.0 mol/L槲皮素50.0 mol/L JAK2/STAT3通路抑制剂AG490)和激活剂组(50.0 mol/L槲皮素0.5 mol/L JAK2/STAT3通路激活剂col
3、ivelin),干预24 h后,用倒置显微镜、Transwell小室及Western blot法对细胞形态、迁移、侵袭及JAK2/STAT3通路和EMT相关蛋白的表达水平进行分析。试验结果显示:CCK-8法确定槲皮素最适作用浓度为50.0 mol/L;与对照组比较,槲皮素组和阳性药物组细胞生长受到抑制,细胞迁移数、侵袭数、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(FN)、p-JAK2和p-STAT3表达水平降低(P0.05),E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平升高(P0.05);与槲皮素组相比,抑制剂组上述指标变化趋势更为显著(P0.05),激活剂
4、组则扭转了这些指标的变化(P0.05)。槲皮素可抑制人软骨肉瘤SW-1353细胞的生长、迁移、侵袭和EMT进程,其作用机制可能与阻滞JAK2/STAT3信号通路相关。关键词:软骨肉瘤;槲皮素;JAK2/STAT3信号通路;迁移;侵袭中图分类号:Q811.4 文献标志码:A DOI:10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.007Effect of Quercetin on Chondrosarcoma Cell Migration,Invasion and EMT by Blocking JAK2/STAT3 Signaling PathwayLI Yi1,ZHANG
5、Heng2,ZHAO Weibiao1*(1.Department of Orthopedics,Liaoning Jinqiu Hospital,Shenyang 110016,China;2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)Abstract:To investigate the effects of quercetin on human chondrosarcoma cell migration,invasion a
6、nd epithelial intersti-tial transformation(EMT)and the regulatory role of Janus kinase 2/signal transduction and transcription promoter 3(JAK2/STAT3)signaling pathway,human chondrosarcoma SW-1353 cells were cultured in vitro and treated with quercetin of differ-ent concentrations for 24 h.The optima
7、l concentration of quercetin(50.0 mol/L)was selected by cell counting kit(CCK-8)for subsequent experiments.The cells were divided into control group with no intervention,quercetin group with 50.0 mol/L quercetin,positive control group with 6.0 mol/L adriamycin,inhibitor group involving 50.0 mol/L qu
8、ercetin+50.0 mol/L JAK2/STAT3 pathway inhibitor AG490,and activator group involving 50.0 mol/L quercetin+0.5 mol/L JAK2/STAT3 path-way activator colivelin.After 24 h of intervention,cell morphology,migration,invasion,and expression levels of JAK2/STAT3 pathway and EMT-related proteins were analyzed
9、by inverted microscope,Transwell chamber and Western blot.The experimen-241第 3 期软骨肉瘤(chondrosarcoma)是起源于软骨细胞的恶性骨肿瘤之一,其最常见的症状是局部性疼痛1。软骨肉瘤对放、化疗不敏感,耐药性强,通常采用手术广泛切除,但手术预后较差、极易复发2-3。因此,迫切需要寻找敏感性强、效价高、副作用低的抗肿瘤药物以治疗软骨肉瘤,而中医药在传统医学里已发展两千多年,有很多关于中药治疗软骨肉瘤的研究4。槲皮素(quercetin)是一种广泛存在于蔬菜和水果中的黄酮类化合物,具有降三高、抗氧化、抗病毒、抗
10、癌、抗炎、对神经和心脏有保护作用等多种特性5-6,而且还具有抗肿瘤活性7。有多项研究报道,槲皮素可以抑制卵巢癌8、前列腺癌9及骨肉瘤10等多种肿瘤细胞的侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。但槲皮素对软骨肉瘤细胞的抗肿瘤机制仍不十分明确,基于此,本研究利用槲皮素干预对软骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT的作用机制做进一步的探讨,以期为槲皮素开发成肿瘤治疗新药提供一定的理论基础。1材料与方法1.1材料人软骨肉瘤SW-1353细胞,购自武汉普诺赛生命科技有限公司;槲皮素、阿霉素(上海源叶生物科技有限公司,纯度98%),Janus激酶2/信号转
11、导和转录启动因子3(Janus kinase 2/signal transduction and transcription promoter 3,JAK2/STAT3)通路抑制剂AG490、激活剂colivelin(上海源叶生物科技有限公司,纯度99%),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,美国Gibco公司),L-15培养基、RIPA裂解液、细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)(艾美捷科技有限公司),结晶紫染色液 生工生物工程(上海)股份有限公司,基质胶(美国ABC公司),JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、E-钙黏蛋
12、白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(fibronectin,FN)与-actin一抗、二抗包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)标记的羊抗鼠IgG(H+G)和AP标记的羊抗兔IgG(H+G)、青霉素-链霉素溶液(100)均来源于武汉三鹰生物技术有限公司。DXS_3型倒置荧光显微镜购自上海缔伦光学仪器有限公司,THZ-98A型二氧化碳培养箱购自上海博迅实业有限公司,Infinite F200型Spark多功能酶标仪购自帝肯(上海)贸易有限公司,GelDoc2000型凝胶成像系统购自美国Backman公
13、司等。1.2方法1.2.1人软骨肉瘤SW-1353细胞培养人软骨肉瘤SW-1353 细胞生长于L-15 培养基(含10%FBS、1青-链霉素)中,并置于37、100%空气培养箱中培养,取对数生长期SW-1353细胞用于试验。1.2.2分组及给药用不同浓度(12.5、25.0、50.0、100.0 和200.0 mol/L)槲皮素干预SW-1353细胞24 h,对照组细胞不做干预,CCK-8 法筛选出最适浓度(50.0 mol/L)进行后续试验。再将细胞分为对照组(不做干预)、槲皮素组(50.0 mol/L槲皮素)、阳性药物组(6.0 mol/L阿霉素11)、抑制剂组(50.0 mol/L槲皮素
14、 50.0 mol/L JAK2/STAT3 通路抑制剂AG490 12联合干预)和激活剂组(50.0 mol/L槲皮素0.5 mol/L JAK2/STAT3通路激活剂colivelin 13联合干预),干预24 h,每个试验重复3次,并设3个复孔。1.2.3CCK-8法测定人软骨肉瘤SW-1353细胞活性细胞分组与给药方法同 1.2.2,将对数期生长的细胞胰酶消化后用完全细胞培养液重悬,细胞传代并以5103个/孔的密度铺于96孔板中。以不加细胞只加培养基的孔为空白组,药物处理24 h和tal results showed that the optimum concentration of
15、quercetin was determined by CCK-8 method to be 50.0 mol/L.Compared with the control group,the growth of quercetin group were positive control group were inhibited,the cell migration number,invasion number,expression levels of N-cadherin,Vimentin,fibronectin(FN),p-JAK2 and p-STAT3 in quercetin group
16、and positive control group decreased(P0.05),E-cadherin expression level increased(P0.05);compared with quercetin group,the change trend of the above indexes in inhibitor group was more significant(P0.05),while the change of these indexes in activator group was reversed(P0.05).Quercetin can inhibit t
17、he growth,migration,invasion and EMT progression of human chondrosarcoma SW-1353 cells,possibly by blocking the JAK2/STAT3 signaling pathway.Key words:chondrosarcoma;quercetin;JAK2/STAT3 signaling pathway;migration;invasion (Acta Laser Biology Sinica,2023,32(3):240-246)页眉文章标题李毅等:槲皮素阻滞JAK2/STAT3信号通路对
18、软骨肉瘤细胞迁移、侵袭和EMT的抑制作用研究李毅等:槲皮素阻滞JAK2/STAT3信号通路对软骨肉瘤细胞迁移、侵袭和EMT的抑制作用研究激光生物学报242第 32 卷48 h后,各孔加入体积分数为10%的CCK-8溶液,孵育2 h后,检测各孔在450 nm的吸光度(optical density,OD)值。细胞活力/%=(OD不同浓度槲皮素组OD空白组)/(OD对照组OD空白组)100%。1.2.4倒置显微镜观察人软骨肉瘤SW-1353细胞的形态细胞分组与给药方法同1.2.2,在倒置显微镜下记录细胞形态。1.2.5Transwell小室法测定SW-1353细胞的迁移和侵袭能力细胞分组及干预同
19、1.2.2,各组细胞在药物干预 24 h后,重悬在无血清的完全培养基中,并将1105个细胞接种到Transwell小室的腔室中,Transwell小室和24孔板之间的腔室中加入500 L含10%FBS的完全培养基。细胞在37中继续培养24 h,小室下表面的细胞与4%组织细胞固定液室温孵育15 min,再与1%结晶紫染色液室温孵育20 min。在侵袭能力分析试验时,小室提前用基质胶预处理,其他步骤相同。显微镜下记录采集图像;Image-J图像分析细胞迁移或侵袭数。1.2.6Western blot法检测SW-1353细胞中蛋白的表达水平细胞分组与给药方法同1.2.2,收集各组细胞,并将细胞悬浮在
20、预冷的放射免疫沉淀分析法(ra-dio immuno precipitation assay,RIPA)裂解液中30 min,12 000 r/min冷冻离心10 min后收集上清液。目的蛋白先用凝胶电泳进行分离,后经聚偏二氟乙烯膜转印电泳、封闭、一抗孵育、二抗孵育及膜显色。在凝胶成像系统上采集蛋白条带并用系统配备的分析软件进行蛋白灰度值分析,以-actin为内参。蛋白相对表达水平为目标蛋白灰度值与-actin灰度值的比值。1.3统计学分析数据分析在SPSS 24.0软件上进行,符合正态分布的数据表示为平均数标准差(xs),数据分析多组间采用单因素方差分析,进一步两两比较用Students t
21、检验。P0.05),25.0、50.0、100.0和200.0 mol/L槲皮素组差异有统计学意义(P0.05),100.0和200.0 mol/L槲皮素细胞活力低于半抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50);干预48 h时,细胞降低趋势与干预24 h相似,25.0、50.0、100.0和200.0 mol/L槲皮素均显著降低(P0.05)。为了排除细胞活力对SW-1353细胞迁移和侵袭能力的影响,本研究选择了干预时间较短(24 h)、细胞活力显著降低且相较于IC50稍高的槲皮素浓度(50.0 mol/L)。2.2槲皮素通过阻滞 JAK2/STAT3 通路抑
22、制SW-1353细胞的生长利用倒置显微镜观察了各组SW-1353细胞形态的变化发现,与对照组比较,槲皮素组、阳性药物图1槲皮素干预对SW-1353细胞活力的影响Fig.1Effect of quercetin intervention on SW-1353 cell viability与24 h对照组相比,aP0.05;与48 h对照组相比,bP0.05。aP0.05 vs.24 h control group;bP0.05 vs.48 h control group.243第 3 期组、抑制剂组细胞的生长受到抑制,激活剂组细胞生长抑制作用不明显,与槲皮素组相比,抑制剂组细胞生长抑制作用明显,
23、具体情况见图2。2.3槲皮素通过阻滞 JAK2/STAT3 通路抑制SW-1353细胞的迁移Transwell小室测定细胞的迁移能力显示,干预24 h,槲皮素组和阳性药物组迁移细胞数较对照组下调(P0.05),抑制剂组迁移细胞数明显低于槲皮素组(P0.05),激活剂组细胞迁移数明显高于槲皮素组(P0.05),具体情况见图3。2.4槲皮素通过阻滞 JAK2/STAT3 通路抑制SW-1353细胞的侵袭Transwell小室测定细胞的侵袭能力显示(图4),干预24 h,槲皮素组和阳性药物组侵袭细胞数均显著低于对照组(P0.05),侵袭细胞数在抑制剂组明显低于槲皮素组(P0.05),在激活剂组明显高
24、于槲皮素组(P0.05)。2.5槲皮素通过阻滞 JAK2/STAT3 通路抑制SW-1353的EMT进程与对照组相比,E-cadherin蛋白表达水平在槲皮素组和阳性药物组上调,N-cadherin、Vimentin和FN三个蛋白水平在槲皮素组和阳性药物组下调(P0.05);较槲皮素组,E-cadherin蛋白水平在抑制剂组较高,在激活剂组较低,N-cadherin、Vimentin和FN在抑制剂组较低,在激活剂组较高(P0.05),具体情况见图5。2.6槲皮素抑制SW-1353细胞中JAK2/STAT3信号通路的活化状态为了研究槲皮素对JAK2/STAT3 信号通路活化状态的影响,检测了该通
25、路的关键性蛋白JAK2、图2倒置显微镜观察各组SW-1353细胞的形态变化(20)Fig.2Morphological changes of SW-1353 cells in each group under inverted microscope(20)图3Transwell小室测定各组SW-1353细胞的迁移情况(20)Fig.3Transwell chamber assay for migration of SW-1353 cells in each group(20)(a)细胞迁移图;(b)迁移细胞数。与对照组相比,*P0.05;与槲皮素组相比,#P0.05。(a)Cell migra
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