黑质致密部-纹状体多巴胺能通路的上游脑区追踪.pdf
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1、第5 9卷 第3期2 0 2 3年0 6月青 岛 大 学 学 报(医 学 版)J OUR NA LO FQ I N G D AOUN I V E R S I T Y(ME D I C A LS C I E N C E S)V o l.5 9,N o.3J u n e 2 0 2 3 收稿日期2 0 2 2-1 2-0 1;修订日期2 0 2 3-0 6-1 7 基金项目国家自然科学基金项目(3 1 8 7 1 2 0 2)第一作者商晓钰(1 9 9 9-),女,硕士研究生。通信作者徐华敏(1 9 8 0-),女,博士,教授,博士生导师。E-m a i l:h u a m i n x u q d
2、 u.e d u.c n。黑质致密部-纹状体多巴胺能通路的上游脑区追踪商晓钰,张腾元,谢俊霞,徐华敏(青岛大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 2 6 6 0 7 1)摘要 目的 探究投射到纹状体(S t r)的黑质致密部(S N p c)多巴胺(D A)能神经元的上游脑区。方法 采用逆向病毒示踪技术逆向追踪S N p c-S t r环路的上游脑区。应用立体定位技术在8周龄C 5 7 B L/6雄性小鼠S t r区注射逆行追踪病毒r AAV-h s y n-c r e-w p r e-p A(r e t r o);同时在S N p c注射病毒AAV-D I O-E F 1 -G
3、 F P-TVA和AAV-D I O-E F 1 -R V G(12混合);3周后在S N p c注射逆行跨突触狂犬病毒R V-E n v a-G-d s R e d。1周后取脑进行冷冻切片,应用O l y m p u sV S 1 2 0荧光显微镜观察表达d s R e d阳性细胞的脑区。结果 应用荧光显微镜在S N p c可以观察到G F P(绿色)和d s R e d(红色)阳性细胞,证明依赖C r e重组酶表达的AAV-D I O-E F 1 -G F P-TVA病毒以及依赖TVA元件表达的狂犬病毒均在S N p c正常表达。同时在外侧下丘脑(LH)、前连合后肢间质核(I P A C)
4、脑区观察到d s R e d(红色)阳性细胞。结论 LH和I P A C脑区可能是S N p c-S t r环路D A能神经元的上游脑区。关键词 多巴胺能神经元;密部;纹状体;下丘脑区,侧;前连合,大脑;神经解剖束追踪技术 中图分类号 R 3 3 8.2 文献标志码 A 文章编号 2 0 9 6-5 5 3 2(2 0 2 3)0 3-0 3 4 9-0 4d o i:1 0.1 1 7 1 2/j m s.2 0 9 6-5 5 3 2.2 0 2 3.5 9.0 9 9 开放科学(资源服务)标识码(O S I D)网络出版 h t t p s:/l i n k.c n k i.n e t/
5、u r l i d/3 7.1 5 1 7.R.2 0 2 3 0 8 0 4.1 5 2 1.0 0 1;2 0 2 3-0 8-0 7 1 5:3 4:5 3AT R A C I N GS T U D Y O FU P S T R E AM B R A I N R E G I O N SO FD O P AM I N E R G I CP A T HWA YP R O J E C T I N GF R OM S U B S T A N T I AN I G R AP A R SC OMP A C T AT OS T R I A T UM SHANGX i a o y u,ZHANGT e
6、n g y u a n,X I EJ u n x i a,XU H u a m i n(D e p a r t m e n to fP h y s i o l o g ya n dP a t h o p h y s i o l o g y,S c h o o l o fB a s i cM e d i c i n e,M e d i c a lC o l l e g eo fQ i n g d a oU n i v e r s i t y,Q i n g d a o2 6 6 0 7 1,C h i n a)A B S T R A C T O b j e c t i v e T o i n v
7、 e s t i g a t e t h eu p s t r e a mb r a i nr e g i o n so fd o p a m i n e r g i cn e u r o n sp r o j e c t i n gf r o mt h es u b s t a n t i an i g r ap a r sc o m p a c t a(S N p c)t o t h e s t r i a t u m(S t r).M e t h o d s T h e r e t r o g r a d ev i r u s t r a c i n g t e c h n i q u
8、ew a su s e d t o i d e n t i f y t h eu p-s t r e a mb r a i n r e g i o n s o f t h eS N p c-S t r c i r c u i t.E i g h t-w e e k-o l dm a l eC 5 7 B L/6m i c e r e c e i v e d s t e r e o t a c t i c i n j e c t i o no f t h e r e t r o g r a d e v i-r u s r AAV-h s y n-c r e-w p r e-p A(r e t r
9、 o)i n t ot h eS t ra n da l s oa12m i x t u r eo fAAV-D I O-E F 1 -G F P-T VAa n dAAV-D I O-E F 1 -R VGi n t ot h eS N p c.A f t e r t h r e ew e e k s,t h er e t r o g r a d e t r a n s s y n a p t i c r a b i e sv i r u sRV-E n v a-G-d s R e dw a s i n j e c t e d i n t ot h eS N p c.A f t e ra n
10、 o t h e ro n ew e e k,t h eb r a i nw a st a k e nt op r e p a r es l i c e st oo b s e r v ed s R e d-p o s i t i v eb r a i nr e g i o n su s i n ga nO l y m p u sV S 1 2 0f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e.R e s u l t s C e l l sp o s i t i v e f o rG F P(g r e e n)a n dd s R e d(r e d)w
11、 e r eo b s e r v e d i nt h eS N p cu n d e r t h e f l u o r e s-c e n c em i c r o s c o p e,d e m o n s t r a t i n gt h a tb o t hC r er e c o m b i n a s e-d e p e n d e n tAAV-D I O-E F 1 -G F P-T VAv i r u sa n dTVA-d e p e n d e n tr a-b i e sv i r u sw e r en o r m a l l ye x p r e s s e d
12、 i nt h eS N p c.A t t h es a m e t i m e,d s R e d-p o s i t i v ec e l l sw e r eo b s e r v e d i nt h e l a t e r a l h y p o t h a l a m u s(L H)a n dt h e i n t e r s t i t i a ln u c l e u so f t h ep o s t e r i o r l i m bo f t h e a n t e r i o r c o mm i s s u r e(I P A C).C o n c l u s i
13、 o n L Ha n d I P A Cm i g h t b et h eu p s t r e a mb r a i nr e g i o n so fd o p a m i n e r g i cn e u r o n so f t h eS N p c-S t r c i r c u i t.K E Y WO R D S d o p a m i n e r g i cn e u r o n s;p a r sc o m p a c t a;c o r p u ss t r i a t u m;h y p o t h a l a m i ca r e a,l a t e r a l;a
14、 n t e r i o rc o mm i s s u r e,b r a i n;n e u r o a n a t o m i c a l t r a c t-t r a c i n gt e c h n i q u e s 帕金森病(P D)是临床较为常见的神经退行性疾病,以静止性震颤、肌强直、运动迟缓等运动症状和嗅觉障碍、睡眠障碍、心血管功能异常等非运动症状为主要临床表现1。P D的主要病理变化为黑质(S N)多巴胺(D A)能神经元进行性退变2,但其发病机制迄今尚不明确。目前有研究认为,S N区D A能神经元所参与的继发性神经环路功能异常可能是导致P D的重要机制之一3。S N分为
15、两部分,即背侧的黑质致密部(S N p c)和腹侧的黑质网状带。其中D A能神经元主要分布于S N p c并向纹状体(S t r)发出投射。此前关于S N p c所接受的脑区输入已有报道4-6,但由于受传统技术的限制,无法区分D A和非D A能神经元所涉及的神经环路,阻碍了对D A能神经元输入的全面理解,且已有的研究也仅限于二级环路的研究7-8。因此,研究S N p c-S t r环路D A能神经元所接受的上游脑区投射,从而确定一个三级环路对于P D的神经环路研究有重要意义。本实验采用南加州大学张砺教授实验室研发的逆向三级环路追踪病毒9,对S N p c-S t r环路D A能神经元的上游脑区
16、进行了研究。3 5 0青 岛 大 学 学 报(医 学 版)5 9卷1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 8周龄S P F级雄性C 5 7 B L/6小鼠,体质量为(2 12)g,购于北京维通利华实验动物有限公司。小鼠饲养于有适量食物和水的洁净动物房内,可以自由饮食。动物房室温(2 22),湿度(5 02)%,1 2/1 2h昼夜循环光照。小鼠适应性饲养1周后进行实验。动物使用和管理经青岛大学动物伦理委员会批准。1.1.2 实验病毒 r AAV-h s y n-c r e-w p r e-p A(r e t r o)(血清型2/9,滴度5.9 7 E+1 5v g/L),购于武汉枢
17、密脑科学技术有限公司;AAV-D I O-E F 1 -G F P-T VA(血清型9,滴度2.5 E+1 5v g/L)、AAV-D I O-E F 1 -R VG(血清型9,滴度2.3 3 E+1 5v g/L)、R V-E n v a-G-d s R e d(滴度2.0 E+1 1v g/L),购于布林凯斯(深圳)生物技术有限公司。1.2 实验方法1.2.1 立体定位注射实验 小鼠用异氟烷麻醉后固定在脑立体定位仪上,麻醉后的小鼠放置在加热垫上保持正常体温。将玻璃电极中注满液体石蜡后固定于微量注射泵(瑞沃德,中国)上,并吸取适量病毒。待小鼠深度麻醉后调整耳杆使小鼠头部位于一平面上,用碘附消
18、毒后剪开小鼠颅脑背侧头皮,用生理盐水擦拭颅骨表面至颅缝和前后囟清晰可见,调整前后囟位置及旁开位置,将前囟点设为零点。根据小鼠脑定位图谱定位注射点后利用颅骨钻进行颅骨钻孔(直径为0.5mm),将玻璃电极插入目标脑区后以2 0n L/m i n的流量进行病毒注射,注射完毕缝合头皮。S t r区病毒注射:将逆行追踪病毒r AAV-c r e-w p r e-p A(r e t r o)单侧注射于C 5 7 B L/6成年雄性小鼠的S t r脑区,以前囟点作为原点,定位坐标为前后+1.1 8mm、侧 偏-1.5 0 mm、深 度-3.0 0 mm。S N p c病毒注射:将AAV-D I O-E F
19、1 -G F P-T VA病毒和AAV-D I O-E F 1 -R VG病毒以12比例充分混合(简称混合病毒),单侧注射于C 5 7 B L/6成年雄性小鼠的S N p c脑区,以前囟点为原点,坐标为前后-3.1 6mm、侧偏-1.4 2mm、深度-4.3 0mm。3周后向小鼠同侧S N p c原位置注射逆行跨突触狂犬病毒R V-E n v a-G-d s R e d。病毒注射完成7d后进行心脏灌流取脑。1.2.2 小鼠脑组织切片样本制备及观察 小鼠腹腔注射1 2.5g/L阿佛丁进行全身麻醉(注射剂量0.0 2m L/g),等待小鼠深度麻醉后剪开胸廓充分暴露心脏,使用生理盐水(国药,中国)和
20、4 0g/L多聚甲醛(索莱宝,中国)进行灌注并取脑。将鼠脑置于4 0g/L多聚甲醛中固定1 2h,再放入3 0 0g/L蔗糖中沉糖4 8h,待样品沉入蔗糖溶液底部。取出脑组织,使用冷冻切片机制备3 0m厚脑切片。脑片在0.0 1m o l/LP B S中清洗3次,每次5m i n,贴片,使用含D A P I封片液(碧云天,中国)封片,在O l y m p u sV S 1 2 0荧光显微镜2 0倍物镜下观察。2 结 果本实验首先将表达C r e重组酶的腺相关病毒r AAV-c r e-w p r e-p A(r e t r o)注射到小鼠单侧背外侧纹状体,同时在同侧S N p c注射依赖C r
21、 e的混合病毒,3周后在S N p c再次注射依赖混合病毒的逆行狂犬病毒R V-E n v a-G-d s R e d,注射1周后通过荧光显微镜观察荧光蛋白表达情况(图1 A)。结果显示,在S N p c可见G F P阳性神经元(绿色荧光)(图1 B),表明r AAV-c r e-w p r e-p A(r e t r o)由S t r逆行至S N p c胞体。同时,在S N p c还观察到d s R e d阳性神经元(红色荧光)(图1 C、D),说明T VA依赖的狂犬病毒在S N p c可正常表达。另外,在外侧下丘脑(LH)和前连合后肢间质核(I P A C)均可见明显的d s R e d阳
22、性神经元(图1 E、F),这表明狂犬病毒和R VG在S N p c共同表达并具有逆向跨突触功能,可逆向追踪上游脑区。上述结果提示LH和I P A C可能是调控投射至S t r的S N p cD A能神经元的上游脑区。3 讨 论P D是继阿尔兹海默病后的第二大神经退行性疾病,多发生于中老年人。自1 8 1 7年由P A R K I N-S ON1首次报道以来,P D的研究已经取得了诸多重要进展。研究表明,P D的发病与年龄老化、氧化应激、炎症反应、环境因素、遗传因素等均有关1 0。P D主要临床表现有运动迟缓、静止性震颤、姿势反射障碍等1 1-1 2。有研究认为,投射至S t r的S N p c
23、D A能神经元退变和继发性神经环路功能异常,可能是导致P D症状发生发展的重要机制,也是脑深部电刺激(D B S)治疗P D的干预靶点1 3-1 5。目前治疗P D最有效的方法依然是药物治疗,如左旋多巴类药物和多巴胺受体激动剂等1 6。近年来D B S也成为临床治疗P D的有效手段。例如 3期商晓钰,等.黑质致密部-纹状体多巴胺能通路的上游脑区追踪3 5 1A:追踪S N p c-S t r环路D A能神经元上游脑区的病毒注射示意图;B:S N p c中T VA-G F P阳性神经元(绿色);C:S N p c中R V-d s R e d阳性神经元(红色);D:S N p c中T VA-G F
24、 P(绿色)和R V-d s R e d(红色)的共同表达(黄色);E、F:L H及I P A C中R V-d s R e d阳性神经元(红色)。图1 S N p c-S t r环路D A能神经元的上游脑区追踪在苍白球内侧1 7、丘脑底核1 8、脚桥核以及腹侧中间核1 9等部位进行D B S均对P D病人起到了较为明显的治疗效果。虽然D B S治疗已经初步取得成效,但是仍有许多D B S治疗靶点的作用机制尚待阐明。作为基底神经核重要组成部分和主要负责D A传输的S N p c,由于与P D密不可分的联系,更是许多研究的重点方向。而探究投射到S t r的D A能神经元的上游脑区,对于进一步阐明P
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