枸杞叶多酚的超声辅助酶法提取工艺优化及抗氧化活性分析.pdf
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1、山西农业科学 2023,51(9):1060-1068Journal of Shanxi Agricultural Sciences枸杞叶多酚的超声辅助酶法提取工艺优化及抗氧化活性分析闫帅帅,晋程妮,武颖,徐建国,张亮亮(山西师范大学 食品科学学院,山西 太原 030031)摘要:对枸杞叶中具有生物活性的化合物进行提取是提升枸杞资源利用效率的前提。为了提高枸杞叶中多酚物质的提取效率及探究其生物活性功能,以枸杞叶为试验原料,基于超声波辅助酶法探究乙醇体积分数、料液比、超声时间和纤维素酶添加量等 4个单因素对枸杞叶多酚提取效率的影响,通过响应面分析优化枸杞叶多酚的提取工艺,并探究枸杞叶多酚提取物对
2、 DPPH 和 ABTS自由基的清除能力。结果表明,4个单因素对枸杞叶多酚提取效率均具有一定影响,枸杞叶多酚提取效率均呈先升高后降低的趋势;经过拟合优化取得最优的提取条件为:乙醇体积分数 68%、料液比 1 89(g/mL)、超声时间 39 min、纤维素酶添加量 2 mg/g,在此条件下,枸杞叶提取液中多酚含量为 5.09 mg/g,与预测值(5.21 mg/g)的相对误差仅为 2.3%。抗氧化试验表明,枸杞叶多酚提取物对 DPPH 和 ABTS 自由基的清除率随着溶液多酚质量浓度的增加而升高,半数抑制浓度 IC50值分别为 27.28、190.00 g/mL,表明具有较好的抗氧化能力。综上
3、,超声辅助酶法可提高枸杞叶多酚的提取效率,所提取的枸杞叶中多酚具有明显的体外抗氧化活性。关键词:枸杞叶多酚;超声辅助酶法;响应面分析法;抗氧化活性中图分类号:TS209 文献标识码:A 文章编号:10022481(2023)09106009Optimization of Ultrasound-Assisted Enzymatic Extraction Technology and Antioxidant Activity of Polyphenols from Lycium barbarum LeavesYAN Shuaishuai,JIN Chengni,WU Ying,XU Jianguo
4、,ZHANG Liangliang(College of Food Science,Shanxi Normal University,Taiyuan 030031,China)Abstract:The extraction of bioactive compounds from Lycium barbarum leaves is the premise to improve the utilization efficiency of Lycium barbarum resources.In order to improve the extraction efficiency and explo
5、re biological activity of polyphenols from Lycium barbarum leaves,in this study,taking Lycium barbarum leaves as the test material,the effects of four single factors including ethanol volume fraction,solid-liquid ratio,ultrasonic time,and the amount of cellulase added on the extraction efficiency of
6、 polyphenols from Lycium barbarum leaves were investigated using the ultrasonic-assisted enzymatic extraction.The response surface analysis was used to optimize the extraction technology of polyphenols from Lycium barbarum leaves and the scavenging ability of polyphenol extracts from Lycium barbarum
7、 leaves on DPPH and ABTS free radicals was studied.The results showed that the four single factors had the same trend that increased first and then decreased on the extraction efficiency of polyphenols from Lycium barbarum leaves.After design optimization,the optimal extraction conditions were defin
8、ed with:68%of ethanol volume fraction,1 89(g/mL)of solid-liquid ratio,39 min of ultrasonic time,and 2 mg/g of cellulase,while the content of polyphenols from Lycium barbarum leaves obtained under this condition was 5.09 mg/g,which had a relative error with the predicted value(5.21 mg/g)was 2.3%.The
9、results of antioxidant activities showed that the removal rate of the polyphenols from Lycium barbarum leaves on DPPH and ABTS increased with increasing mass concentration of polyphenols.The IC50 values of half inhibitory concentration were 27.28 g/mL and 190 g/mL,respectively,which indicated that L
10、ycium barbarum leaves had excellent antioxidant capacity.In conclusion,the extraction efficiency of polyphenols from Lycium barbarum leaves could be improved by ultrasonic-assisted enzymatic extraction,and the polyphenols extracted from Lycium barbarum leaves had significant antioxidant activity in
11、vitro.Key words:polyphenols from Lycium barbarum leaves;ultrasound-assisted enzymatic extraction technology;response surface methodology;antioxidant activitydoidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.09.11收稿日期:2023-01-06基金项目:山西省自然科学基金项目(202103021223247);山西师范大学自然科学基金基础研究项目(02080183)作者简介:闫帅帅(1994-),男,山西晋城人,
12、讲师,博士,主要从事食品营养与安全研究工作。1060闫帅帅等:枸杞叶多酚的超声辅助酶法提取工艺优化及抗氧化活性分析枸杞作为一种药食同源类物质,被 中华人民共和国药典 2020 版收录,具有较高的药用价值和营养保健功效1-3。本草纲目 中曾记载,枸杞叶又名天精草,是指枸杞嫩茎部位在春天长出的新鲜芽叶4。据研究发现,枸杞叶具有与枸杞相近的化学组成,不仅含有大量的蛋白质、膳食纤维、多种氨基酸等营养成分,还包括黄酮、多酚、多糖和萜类等多种生物活性物质,具有抗氧化、抗炎、降血糖、改善精神疾病等生理功效5-8。因此,枸杞叶的潜在医食利用价值和开发应用前景值得关注。枸杞叶作为枸杞栽培过程中主要的副产物,除被
13、少量的用于茶饮和新鲜食用外,每年造成近百万吨的废弃,提升对枸杞叶副产品的精深加工至关重要9。广泛存在于植物原料中的多酚类物质作为开发功能性产品的热点之一,在食品、医药、化工等领域得到应用10-11。闫亚美等12研究表明,不同品种枸杞叶中黄酮、多酚、氨基酸含量差异较大,且多酚类物质含量最高。并且植物多酚提取物的生物活性、提取效率与提取方法密切相关,常用的提取方法有溶剂萃取法、超临界流体萃取法、超声波辅助浸提法、微波辅助提取法、酶工程技术等。研究表明,多技术协同提取法在多酚提取效率、纯度等方面均优于单一提取技术13-14。何若男等15运用响应面法优化了微波-超声波协同技术提取黑枸杞叶多酚的试验参数
14、,提高了枸杞叶中多酚的提取效率。具有绿色、高效、操作简单等特点的超声辅助酶法作为一种新兴的提取技术,广泛应用于植物材料中多酚的获取16-17,但鲜有采用超声辅助酶法提取枸杞叶多酚的报道。本试验以枸杞叶为原料,通过超声波辅助酶法优化枸杞叶多酚的提取工艺,并对枸杞叶多酚清除自由基能力进行探究,旨在为开发枸杞叶精深加工利用,丰富副产品种类提供参考。1 材料和方法1.1试验材料与试剂供试枸杞叶为市售,产于宁夏。没食子酸、福林酚、无水碳酸钠、纤维素酶,上海源叶生物科技有限公司生产;DPPH、ABTS(纯度99%),美国 Sigma公司生产。1.2仪器与设备真空冷冻干燥机(LGJ-30F 型,北京松源华兴
15、科技发展有限公司);紫外可见分光光度计(LN-1800PC 型,上海美谱达仪器有限公司);超声波清洗机(CQ-250A-DST 型,上海恒悦医疗器械有限公司);粉碎机(SS-1022 型,永康市红太阳机电有限公司);低速台式离心机(TDL-60C 型,上海安亭科学仪器厂)。1.3试验方法1.3.1枸杞叶多酚提取在真空冷冻干燥机中将枸杞叶进行干燥,粉碎过筛后样品粉末保存于 4 冰箱。取0.10 g粉末样品,设置超声波清洗机的工作条件(温度60、功率100 W),加入已知量的纤维素酶、乙醇溶液,提取适当时间,悬浮液离心(3 000 r/min、10 min)后,收集上清液并定容至 100 mL,得
16、到枸杞叶多酚提取液18。1.3.2多酚含量测定采用福林酚比色法19测定枸杞叶多酚的含量。配制0.10 mg/mL没食子酸标准溶液,分别吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 6个试管中,向各管中加入0.1 mL福林酚试剂和2.8 mL蒸馏水,混匀后再加入 7.5%碳酸钠溶液 2.0 mL,避光静置 1 h,于 765 nm 波长处测定吸光值,绘制标准曲线,得到线性回归方程为:y=76.917x+0.016(R2=0.998 3),其中,y表示吸光度;x表示没食子酸质量浓度(mg/mL)。吸取枸杞叶多酚提取液 0.1 mL,按照没食子酸标准曲线方法步骤操作,根据公式(1)计算
17、多酚含量。W=c V nm(1)式中,W 表示多酚含量(mg/g);c 表示提取液中多酚的质量浓度(mg/mL);V 表示多酚提取液的体积(mL);n 表示稀释倍数;m 表示干燥粉末样品的质量(g)。1.3.3单因素试验分别称取枸杞叶粉末 0.10 g,设置料液比 1 50(g/mL),超声时间 50 min,纤维素酶添加量 2 mg/g,考察乙醇体积分数分别为 10%、30%、50%、70%、90%时对多酚得率的影响;设置乙醇体积分数 70%,超声时间 50 min,纤维素酶添加量 2 mg/g,考察料液比分别为 1 10、1 30、1 50、1 70、1 90(g/mL)时对多酚得率的影响
18、;设置乙醇体积分数 70%,料液比 1 70(g/mL),纤维素酶添加量 2 mg/g,考察超声时间分别为 10、20、30、40、50 min 时对多酚得率的影响;设置乙醇体积分数70%,料液比 1 70(g/mL),超声时间 40 min,考察纤维素酶添加量分别为 0、1、2、3、4 mg/g时对多酚得率的影响。1.3.4响应曲面设计基于 1.3.3 单因素试验,遵1061山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期循 Box-Behnken 效应面法,对 4 个因素(表 1)进行4 因素 3 水平的响应面分析,以多酚得率作为响应值,探究枸杞叶多酚的最佳提取工艺条件20-21。响应面试
19、验因素水平如表 1所示。1.3.5抗氧化指标测定1.3.5.1检测清除 DPPH自由基能力用无水乙醇配制 60 mol/L DPPH 工作液,测定时在 517 nm 波长下,调节其吸光度为 0.700.02。将枸杞叶多酚提取液稀释成不同浓度,分别取 0.5 mL提取液置于4 mL比色皿中,加入 2.5 mL DPPH 溶液,充分反应后,于 517 nm 处测定吸光度,并用 Vc 作为阳性对照22。根据公式(2)计算DPPH自由基清除率。DPPH 自由基清除率=(A0(A1A2))/A0100%(2)式中,A0为空白样品吸光值;A1为提取液溶液的吸光值;A2为样品溶液阴性对照吸光值。1.3.5.
20、2检测清除ABTS自由基能力配制7 mmol/L的 ABTS 溶液和 4.9 mmol/L 的过硫酸钾溶液,等体积混匀后 4 避光放置 12 h,得到 ABTS 母液。在 734 nm 波长下,用无水乙醇稀释母液吸光值至0.700.02,得到ABTS测定溶液。在3.8 mL ABTS测定溶液中,加入 0.1 mL 不同浓度的枸杞叶多酚提取液,于 734 nm 处测定吸光度23,根据公式(3)计算 ABTS自由基清除率。ABTS 自由基清除率=(A0(A1A2))/A0100%(3)1.4数据统计与处理处 理 数 据、绘 图、响 应 面 分 析 由 Origin 8.6、Design-Exper
21、t V 8.0.6软件完成。2 结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1乙醇体积分数对枸杞叶多酚得率的影响由图 1可知,当乙醇体积分数在 10%70%时,多酚得率呈上升趋势,在乙醇体积分数为 70%时多酚得率最高,随后逐步下降。这可能是遵循与溶液极性相似相溶性原则,70%乙醇溶液和提取的多酚相溶24,表明在溶剂中适当加水以增加萃取溶剂的极性是必要的,有利于多酚的提取。综合考虑,响应面优化试验的乙醇体积分数选择50%、70%、90%。表 1 响应面试验因素与水平Tab.1 Response surface test factor and levels水平Level-101因素Factor乙醇体积
22、分数/%(A)Ethanol volume fraction507090料液比(g/mL)(B)Solid-liquid ratio1 501 701 90超声时间/min(C)Ultrasonic time304050纤维素酶添加量/(mg/g)(D)Amount of cellulase123不同小写字母表示差异显著(P0.05)Different lowercase letters indicated significant differences(P0.05)图 14个单因素对枸杞叶多酚得率的影响Fig.1Effect of four single factors on the yie
23、ld of polyphenols from Lycium barbarum leaves1062闫帅帅等:枸杞叶多酚的超声辅助酶法提取工艺优化及抗氧化活性分析2.1.2料液比对枸杞叶多酚得率的影响由图 1可知,当料液比在 1 10(g/mL)1 70(g/mL)时,多酚得率随着料液比的增加而增加,在料液比为 1 70(g/mL)时达到最大值,这可能是由于溶剂用量的增加使得其与枸杞叶粉末的接触面积加大,从而促进了多酚的提取25;当料液比大于 1 70(g/mL)时,多酚得率开始降低,这可能是因为溶剂用量过大,超声波与枸杞叶粉末之间的作用降低,不利于多酚物质溶出。因此,响应面优化试验的料液比选择
24、 1 50、1 70、1 90(g/mL)。2.1.3超声时间对枸杞叶多酚得率的影响图 1显示,超声时间小于 40 min 时,多酚得率与超声处理时间呈正相关,说明超声时间的增加可促进枸杞叶中生物活性化合物多酚的完全溶出26。在超声时间为 40 min 时,多酚得率达到最大值,之后开始降低。这可能是因为细胞内外浓度达到平衡,待溶出的物质较少,提取效率降低。因此,响应面试验的超声时间选择 30、40、50 min。2.1.4纤维素酶添加量对枸杞叶多酚得率的影响图 1 显示,纤维素酶添加量小于 2 mg/g 时,多酚得率趋势相对陡峭,这可能是由于酶水解有助于溶剂渗透,通过增加基质孔隙率,使酚类化合
25、物溶出27。当酶添加量为23 mg/g时,多酚得率增长趋于平缓,可能是由于酶量的增加加快了酶解速度,提高了部分多酚溶出量。当酶添加量高于 3 mg/g时,多酚得率出现下降趋势,可能与分解的纤维素造成多酚逸出孔隙堵塞有关28。因此,响应面试验的纤维素酶添加量选择 1、2、3 mg/g。2.2响应面试验优化2.2.1响应面试验结果基于回归拟合分析(表2),得出 4个因素与枸杞叶多酚得率之间的二次回归拟合方程:Y=5.160.19A+0.087B+0.047C+0.12D+0.082AB+0.059AC0.028AD0.20BC0.097BD+0.005 25CD0.68A20.052B20.63C
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