黄粉虫蛋白替代豆粕影响尼罗罗非鱼肝肠健康的机制探究.pdf
《黄粉虫蛋白替代豆粕影响尼罗罗非鱼肝肠健康的机制探究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《黄粉虫蛋白替代豆粕影响尼罗罗非鱼肝肠健康的机制探究.pdf(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.001黄粉虫蛋白替代豆粕影响尼罗罗非鱼肝肠健康的机制探究张 乐,孙 其,李玮洁,吴红霞,乔 芳,杜震宇,陈立侨,张美玲(华东师范大学 生命科学学院,上海 200241)摘 要 为探究黄粉虫蛋白替代豆粕对鱼类肝肠健康的影响及其机制,以尼罗罗非鱼为试验鱼,使用黄粉虫蛋白粉分别替代饲料中 0、15%、30%和 45%的豆粕,制成 4 组等氮(320 g/kg 粗蛋白)等能(16.8 MJ/kg)的饲料,开展为期10 周养殖试验,并对鱼体肝肠健康相关指标进行检测分析。结果显示:黄粉虫蛋白能够替代尼罗罗非鱼饲料中15%的豆粕而不显
2、著影响其肝肠健康;当替代比例达到 30%,尼罗罗非鱼肠道肌层厚度变薄,肠道绒毛变短,肠道跨上皮电阻下降,肠道屏障相关基因表达上调;当替代比例增加至 45%,肠道损伤进一步加剧,肝脏发生损伤,表现为血清谷丙转氨酶活力显著升高,肝细胞边界模糊、脂滴蓄积,肝脏总脂、甘油三酯、游离脂肪酸和糖原含量显著升高。转录组测序分析结果显示:45%替代组的尼罗罗非鱼肝脏中糖原合成和凋亡相关通路显著上调;肝脏和肠道组织中的氧化应激相关基因 klf9 均显著上调,说明在黄粉虫蛋白高比例替代组存在氧化应激。关键词 昆虫粉;豆粕替代;黄粉虫;肝肠健康;罗非鱼中图分类号 S963.32;S965.125文献标识码 A文章编
3、号 2095-1736(2023)04-0001-10Effects of yellow mealworm Tenebrio molitor meal replacingsoybean meal on the hepatic and intestinal health of Nile tilapia Oreochromis niloticus and mechanism explorationZHANG Le SUN Qi LI Weijie WU Hongxia QIAO Fang DU Zhenyu CHEN Liqiao ZHANG Meiling School of Life Scie
4、nces East China Normal University Shanghai 200241 China Abstract To evaluate the effects of yellow mealworm meal YM as a partial replacement for soybean meal SBM on the hepatic and intestinal health of fish four groups of isonitrogenous 320 g/kg crude protein and isoenergetic 16.8 MJ/kg experimental
5、 diets were formulated using YM to replace 0 15%30%and 45%SBM in an SBM-based diet for Nile tilapia Oreochromis niloticus.A ten-week feeding experiment was conducted and the parameters related to the hepatic and intestinal health were analyzed.The results indi-cated that YM could replace 15%SBM in t
6、ilapia feed without negative effects on the hepatic and intestinal health.However when the replacement ratio was up to 30%decreased intestinal muscular thickness shorter intestinal villi lower intestinal transepithelial elec-trical resistance and higher mRNA expression level of tight junction protei
7、n-related genes were observed.When the replacement ratio was up to 45%the intestinal injury was further exacerbated and hepatic injury occurred.Hepatic injury was manifested by a signifi-cant increase in serum alanine transaminase activity blurred hepatocyte boundaries lipid droplet accumulation and
8、 a significant in-crease in total lipids triglycerides non-esterified free fatty acids and glycogen content.Transcriptome analysis revealed that genes re-lated to glycogen synthesis and apoptosis were significantly enhanced in liver in YM45.Further analysis revealed that klf9 an oxidative stress-rel
9、ated gene was significantly upregulated in both liver and intestine suggesting that oxidative stress occurred in YM45 group.1第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2023-03-24;最后修回日期:2023-05-05基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFD0900200);国家自然科学基金项目(31972798)作者简介:张乐,硕士研究生,研究方向为肠道微
10、生物与水产动物营养,E-mail:2623658350 通信作者:张美玲,博士,教授,研究方向为肠道微生物与水产动物营养,E-mail:mlzhang Keywords insect meal soybean meal replacement Tenebrio molitor hepatic and intestinal health tilapia 根据联合国粮农组织统计,2020 年全球水产养殖总产量已经达到 1.226 亿吨,对全球水产动物产量的贡献率达到 49.2%1。水产养殖的快速发展使水产饲料的需求量急剧上涨。据预测,到 2025 年,全球水产饲料总产量将从 2015 年的 4 9
11、70 万吨增加至8 710 万吨2。然而,由于海洋渔业资源及耕地资源有限等原因,水产饲料中常用的蛋白源 鱼粉和豆粕供应紧张、价格激增,严重制约水产养殖业的健康快速发展。昆虫作为某些鱼类的天然饮食成分,近年来在水产饲料中受到广泛关注3-4。昆虫的营养组成良好,其蛋白质水平通常在 40%63%,脱脂后的昆虫蛋白粉蛋白质含量可达 83%5。某些双翅目昆虫的氨基酸组成与鱼粉类似,直翅目和鞘翅目昆虫体内的氨基酸结构则与大豆更为接近6-7。一般来说,大多数昆虫的氨基酸组成与水产动物生长需求呈现良好的相关性7。昆虫能够利用餐厨废料等低值副产物进行养殖,对生态系统的影响小,对土地和水资源的消耗也相对较少8;与
12、传统蛋白源鱼粉和豆粕相比,昆虫蛋白源具有更好的环境效益。许多养殖鱼类对昆虫粉具有良好的适应性。例如,非洲鲶(Clarias gariepinus)幼鱼能够适应饲料中添加 172 g/kg 的黑水虻虫粉,鱼体生长、营养利用和健康状况未受负面影响9;在大西洋鲑(Salmo salar)饲料中使用黑水虻虫粉完全替代鱼粉,未见其对鱼体生长、营养组成和肌肉感官特性的负面影响10;红海鲷(Pargus major)在饲喂了使用脱脂黄粉虫粉完全替代鱼粉的饲料后,鱼体生长性能和抗细菌感染能力得到显著提升11;饲料中使用蝇蛆粉替代 60%以下的鱼粉,未见其对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
13、饲料吸收和增重率产生不良影响12。黄粉虫(Tenebrio molitor)为拟步甲科昆虫,是目前常用的昆虫蛋白源之一13。Rema 等13报道,黄粉虫蛋白完全替代饲料中的鱼粉可以促进虹鳟(Oncorhyn-chus mykiss)幼鱼的生长,提高蛋白质效率。日粮中添加 24%和 36%的黄粉虫蛋白的饲料能够通过激活TLR/MyD88/IKK/NFB 信号通路,增强抗凋亡基因的表达,保护大口黑鲈(Micropterus salmoides)免受病原菌引起的肠道细胞凋亡和损伤14。在海鳟(Salmo trutta m.trutta,L.)幼鱼饲料中,用 40%的黄粉虫粉替代鱼粉,对鱼体的生长性能
14、、存活率和饲料利用没有不利影响15。对大多数养殖鱼类来说,饲料中添加 9%38%的黄粉虫粉不会影响其生长性能16。但是当添加水平进一步增加,会对养殖鱼体产生一些负面影响,如抑制生长、影响消化17-18、降低抗氧化酶活力19-20、引起肝损伤21-22和肠道屏障受损15。对昆虫粉高比例替代鱼粉引起负面影响的原因,目前已有一些推测,包括:(1)昆虫粉中几丁质的存在19;(2)饲料 n-3 脂肪酸和 n-6 脂肪酸比例的不平衡23;(3)饲料中某些微量营养素的缺乏,如牛磺酸和某些必需氨基酸4,24;(4)昆虫粉中存在内源性的蛋白酶和酚氧化酶25-26。但是,这些信息都源于替代鱼粉的研究,关于黄粉虫蛋
15、白替代豆粕对鱼体的影响目前研究较少。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是世界第三大养殖鱼类,2020 年全世界总产量已达 440.72 万吨1。豆粕是尼罗罗非鱼商业饲料中主要的蛋白源27。研究发现,黄粉虫蛋白能够替代尼罗罗非鱼饲料中 30%的豆粕而不影响其生长和肌肉品质28,但是关于黄粉虫蛋白替代豆粕对尼罗罗非鱼肝脏和肠道健康的影响及其潜在的机制尚不明晰。因此,研究旨在阐明使用黄粉虫蛋白替代豆粕对尼罗罗非鱼肝脏和肠道健康的影响和可能的原因。1 材料与方法1.1 饲料和养殖管理使用黄粉虫蛋白粉(购自广州泽合成生物技术有限公司,粗蛋白含量 65.88%,粗脂肪含量 4.19%
16、,湿重基础)按照 0、15%、30%和 45%的比例替代尼罗罗非鱼饲料中的豆粕(购自山东渤海实业有限公司,粗蛋白含量 46.05%,粗脂肪含量 1.03%,湿重基础),加工制成4 种等氮等脂(蛋白含量 32%,脂肪含量 6%)的实验饲料(饲料配方详见表 1,其中酪蛋白、豆油、羧甲基纤维素钠、纤维素、抗氧化剂、磷酸二氢钙、氯化胆碱和诱食剂购自湛江市欧迅饲料有限公司,面粉购自五得利面粉集团有限公司,1%预混料购自青岛玛斯特生物技术有限公司),分别命名为 YM0、YM15、YM30 和 YM45。实验所用的尼罗罗非鱼购自广州市添发鱼苗发展有限公司。暂养期间,使用商业饲料(粗蛋白水平 33%,粗脂肪水
17、平 5%)进行喂养。暂养至平均体重达到 70 g后,随机挑选初始重量为(700.12)g 的尼罗罗非鱼 360条,分为 4 组,每组设置 3 个养殖缸(500 L),在室内循环水养殖系统中进行养殖。日投喂量为体重的 4%,于上午 8:00 和下午 17:00 进行投喂。养殖水温控制在26 28,pH 值控制在 7.5 7.9,溶解氧保持在6.5 mg/L 以上,氨氮水平保持在0.02 mg/L 以下,光周期为 12 h 光照/12 h 黑暗。每两周记录一次每缸罗非2第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2
18、023鱼的平均体重,并调整相应的投喂量。养殖试验持续 10 周。表 1 饲料配方及营养水平组成Table 1 Experimental feed formulation and nutrient composition成分Ingredients/(g/kg)组别 GroupsYM0YM15YM30YM45豆粕400340280220黄粉虫蛋白粉04284126酪蛋白85858585面粉400400400400豆油525150481%预混料10101010羧甲基纤维素钠25252525纤维素5.7524.7543.7563.75抗氧化剂0.250.250.250.25磷酸二氢钙15151515氯
19、化胆碱5555诱食剂2222营养成分粗蛋白/%32.4631.5931.6932.40粗脂肪/%6.096.106.126.03果糖含量/(mg/g)0.890.700.730.601.2 样品采集采样前,将尼罗罗非鱼禁食12 h。每组随机选择6条鱼,使用 MS-222 进行麻醉,随后进行尾静脉采血,将采集 的 血 液 样 品 在 4 冰 箱 中 静 置 过 夜 后,3 500 r/min 离心 10 min 获得血清,保存于-80 以备后续分析。取血后,在冰上解剖分离获得肝脏和肠道样品,置于-80 冰箱保存。1.3 生化分析使用南京建成生物技术有限公司商业试剂盒,按照说明书对血清谷草转氨酶和
20、谷丙转氨酶活力、肝脏和肠道的超氧化物歧化酶活力、丙二醛含量和总抗氧化能力以及肝脏的甘油三酯、游离脂肪酸、糖原含量和谷胱甘肽氧化酶活力进行检测。肝脏的糖原合成酶活力以及肝脏和肠道的活性氧含量使用上海恒远生物技术有限公司的酶联免疫吸附法试剂盒进行检测。肝脏总脂含量检测使用氯仿-甲醇法。1.4 组织学分析每个处理组随机选取 3 条鱼的肝脏和肠道用于组织学分析。样品采集后,将组织立即置于 4%的多聚甲醛溶液中固定 24 h,随后置于脱水机中依次进行梯度脱水,进行石蜡包埋和 OCT 包埋。将包埋好的组织样品切成厚度为 5 m 的薄片。对肝脏组织切片分别进行苏木精-伊红(H&E)染色、油红 O 染色以及过
21、碘酸-雪夫(PAS)染色。对肠道组织切片进行苏木精-伊红(H&E)染色。在光学显微镜(尼康,日本)下观察和拍照。肠道肌层厚度、肠绒毛高度和宽度使用图像软件Nis-Elements F package version 4.60 进行测量,每个处理组的肠道切片选取 30 个位点。1.5 肠道通透性分析每个处理组随机选择 6 条尼罗罗非鱼用于分析肠道通透性。用尤斯室灌流系统(金工鸿泰,中国)测定肠道跨上皮电阻(TER)来反映肠道通透性。具体操作步骤参照文献29。1.6 转录组测序分析使用 RNA 提取试剂盒(Promega,美国)提取 YM0和 YM45 组尼罗罗非鱼肝脏和肠道组织的总 RNA,随后
22、使用 带 有 Oligo(dT)的 磁 珠 从 总 RNA 中 分 离mRNA。向分 离 得 到 的 mRNA 中 加 入 fragmentation buffer 将其随机打断,再以片段化的 mRNA 为模板,反转录合成 cDNA。随后对产物进行纯化和片段分选,利用分选产物进行 PCR 扩增,纯化后即得到转录组文库。转录组文库构建完成后,使用 QuantiFluor dsDNA System 进行初步定量,随后利用 Illumina Hiseq X Ten平台对文库进行双端测序。转录组测序原始数据(raw data)已上传至 NCBI,提交号分别为 PRJNA852881(肝脏样本)和 PR
23、JNA910236(肠道样本)。利用软件 fastp 对测序获得的数据进行质控。随后使用软件 HiStat2 与参考基因组比对,以获得用于后续分析的 mapped data。利用 DEGSeq2 软件包分析YM0 和 YM45 组的肝脏、肠道之间的显著差异表达基因(DEGs)。满足 P-adjust2的基因被认定为 DEGs。利用 KEGG 数据库进行差异基因 KEGG 富集分析,当 P-adjust0.05 时,认为该通路在 DEGs 中显著富集。转录组的数据分析在美吉生物云平台()上进行。1.7 实时荧光定量 PCR肝脏和肠道组织样本的 RNA 提取和 cDNA 合成参照文献29。使用 e
24、f1 和-actin 作为管家基因。定量引物在 NCBI 上设计,引物序列详细信息见表 2。使用 CFX96 TouchTM实时荧光定量 PCR 仪(Bio-Rad,美国)进行荧光定量检测。利用 2-Ct法计算 mRNA的相对表达量。1.8 数据分析所有结果均使用平均值标准误表示。使用 SPSS Statistics 20.0 软件(IBM,美国)对数据进行显著性分析。使用 Shapiro-Wilk 检验数据是否符合正态分布。使用单因素方差分析(ANOVA)检验各组间差异的显著性(P0.05,图 1(a)。血清谷丙转氨酶的活力随着黄粉虫蛋白替代豆粕比例增加而逐渐升高,当替代比例达到 45%时,
25、与对照 YM0 组相比呈现显著差异P0.05,图 1(b)。肝脏切片 H&E 染色结果显示,YM45 组尼罗罗非鱼肝细胞边界模糊并伴有较为明显的脂肪变性图 1(c)。油红染色结果显示,随着替代比例的增加,肝脏脂质沉积逐渐加剧图 1(d)和(e)。进一步分析发现,YM45 组罗非鱼肝脏的总脂、甘油三酯以及游离脂肪酸含量显著高于其他 3 组P0.05,图 1(f)(h)。肝脏切片 PAS 染色以及生化分析结果显示,随着替代比例的增加,肝脏糖原逐渐积累,在 YM45 组含量最高P0.05,图 1(i)(k)。肝脏糖原合成酶活力同样呈现随替代比例增加而逐渐升高,并且在 YM45 组具有最高值P0.05
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 黄粉虫 蛋白 替代 豆粕 影响 罗罗 肝肠 健康 机制 探究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。