葛根素通过调控miR-214抑制脊髓损伤后神经元炎症反应及凋亡的实验研究.pdf
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1、收稿日期:2020-12-23;修订日期:2021-03-06作者简介:王光健(1985-),男,重庆籍,主治医师研究方向:骨创伤及基础研究通信作者:王德华电子邮箱:实验研究葛根素通过调控 miR-214 抑制脊髓损伤后神经元炎症反应及凋亡的实验研究王光健,王德华,谭响,谢继勇(重庆市荣昌区人民医院骨科,重庆 402460)摘要:目的 探讨葛根素是否通过介导 miR-214 抑制过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的脊髓神经元炎症反应及凋亡。方法 体外培养大鼠脊髓神经元细胞,以 H2O2刺激构建脊髓神经元损伤模型,实验分为:Con 组、H2O2组、H2O2+Pue 组、
2、H2O2+Pue+anti-miR-NC 组和 H2O2+Pue+anti-miR-214 组。实时荧光定量 PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测各组 miR-214 的表达,CCK-8 法检测细胞活性,DCFH-DA 探针法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,试剂盒检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,酶联免疫吸附测定法分析肿瘤坏死因子-(tumor necrosisfactor-,TNF-)、白细胞介素-1(interleukin-1,I
3、L-1)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白印迹法(Western blot)检测裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(Cleaved caspase-3)表达水平。结果 与 Con 组相比,H2O2组细胞活性、SOD 活性和 miR-214 的表达显著降低,细胞内 ROS 水平、TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量、凋亡率、Cleaved caspase-3 的表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P0.05);与 H2O2组相比,H2O2+Pue 组细胞活性、SOD 活性和 miR-214 的表达明显升高,细胞内 ROS 水平、TNF-、
4、IL-1 和 IL-6 的含量、凋亡率、Cleaved caspase-3 的表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P0.05);抑制 miR-214 能够逆转葛根素对 H2O2诱导的脊髓神经元细胞的损伤保护作用。结论 葛根素能够通过上调miR-214 的表达抑制 H2O2诱导的脊髓神经元细胞凋亡和炎症反应,对脊髓神经元细胞损伤起保护作用。关键词:葛根素;miR-214;脊髓神经元细胞;凋亡;炎症反应中图分类号:R744 文献标识码:A 文章编号:1005-7234(2023)04-0508-05DOI:10.3969/j.issn.1005-7234.2023.04.002The exper
5、imental study of puerarin by regulating miR-214 to inhibit neuronal inflammation and apoptosis after spinalcord injuryWANG Guang-jian,WANG De-hua,TAN Xiang,XIE Ji-yong(Department of Orthopedics,Chongqing Rongchang District Peoples Hospital,Chongqing,402460,China)Abstract:Objective To investigate whe
6、ther puerarin can inhibit the inflammatory response and apoptosis of spinal cord neuronsinduced by hydrogen peroxide(H2O2)by mediating miR-214.MethodsRat spinal cord neuronal cells were cultured in vitro,andH2O2stimulation was used to construct spinal cord neuronal injury models.The experiment was d
7、ivided into:Con group,H2O2group,H2O2+Pue group,H2O2+Pue+anti-miR-NC group and H2O2+Pue+anti-miR-214 group.Real-time fluorescent quantitative PCR(RT-qPCR)was used to detect the expression of miR-214 in each group,CCK-8 method to detect cell viability,DCFH-DA probe todetect intracellular reactive oxyg
8、en species(ROS)levels,the kit to detect superoxide dismutase(SOD)activity,ELISA to analysetumor necrosis factor-(TNF-),interleukin-1(IL-1)and interleukin-6(IL-6)content,flow cytometry to detect cellapoptosis,and Western blot to detect the expression level of cleaved caspase-3.ResultsCompared with th
9、e Con group,the cellactivity,SOD activity and miR-214 expression in the H2O2group were significantly reduced,while the intracellular ROS level,TNF-,IL-1 and IL-6 content,apoptosis rate,cleaved caspase-3 were markedly raised,all with statistically significant difference(P0.05).Compared with the H2O2g
10、roup,the cell activity,SOD activity and miR-214 expression in the H2O2+Pue group significantly increased,and the intracellular ROS level,TNF-,IL-1 and IL-6 content,apoptosis rate,and cleaved caspase-3 expression levels significantlydecreased,and the difference was statistically significant(P0.05).Th
11、e inhibition of miR-214 could reverse the protective effect ofpuerarin on H2O2-induced spinal cord neuronal cell damage.Conclusion Puerarin can inhibit H2O2-induced spinal cord neuronalcell apoptosis and inflammation by up-regulating the expression of miR-214,and thereby protecting spinal cord neuro
12、nal cell injury.Key words:puerarin;miR-214;spinal cord neuronal cells;apoptosis;inflammatory response805颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.4 脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种常见的神经系统疾病,具有高发病率和高死亡率1。SCI 特征是神经组织丧失以及随后的感觉和运动功能缺陷,其不仅对患者造成严重的生理和心理损害,而且对社会构成了巨大的
13、经济负担2。与 SCI 相关的主要病理变化包括神经元损伤和凋亡,这些变化不利于受损组织的修复和治疗,并且 SCI 位点受到炎症细胞引起的炎症产生的影响。过度的炎症反应也会加速神经元坏死和轴突脱髓鞘3,4。目前,SCI 的主要治疗方法包括药物治疗、手术治疗和移植治疗,这些治疗旨在减少继发性损伤并促进神经恢复和再生。但是,在临床上,任何 SCI 治疗都无法完全治愈或发挥显著疗效5。因此,寻找新的和有希望的治疗方法是目前急需解决的问题。葛根素是从传统中药葛根中分离的异黄酮类衍生物,对脑缺血的神经具有保护作用。有研究显示,葛根素可促进 SCI 大鼠运动功能恢复和组织修复,其机制可能与其神经保护、抑制胶
14、质细胞活化、抗炎和抗凋亡作用有关6-8。然而,葛根素通过抑制 SCI 后炎症反应和神经元凋亡对 SCI 所起到的保护作用及其机制目前尚不清楚。因此,本实验旨在探究葛根素对 SCI 损伤的保护作用及其作用机制,以期为 SCI 的治疗提供新的实验依据。1 材料与方法1.1 材料大鼠脊髓神经元细胞(中科院上海细胞资源中心);葛根素,纯度 98%(武汉远成共创科技有限公司);DMEM 培养基、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Gibco 公司);miR-214 inhibitors 和 inhibitors control(上海吉玛制药技术有限公司);LipofectamineTM2000脂质体转染试剂(美国
15、Invitrogeng 公司);RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR 检测试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司);引物(上海生工生物工程有限公司);CCK-8 试剂(日本同仁化学研究所);细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)和白细胞介素-6(in-terleukin-6,IL-6)的酶联免疫吸附测定法检测试剂盒(武
16、汉博士德生物有限公司);Annexin-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(日本 TaKaRa 公司);除抗体外,蛋白印迹法(Western blot)检测所需相关试剂(上海碧云天生物技术研究所);裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(Cleaved caspase-3)单克隆抗体和辣根过氧化酶标记的二抗(美国 Abcam 公司)。1.2 细胞培养和分组处理脊髓神经元细胞以含 10%胎牛血清的 DMEM培养液进行培养,细胞放置在 37、体积分数为 5%CO2、饱和湿度的培养箱中,使用胰蛋白酶进行消化传代,对数期的细胞用于后续实验。将对数期的脊髓神经元随机分为 Con 组、H2O2组、H2O2+Pue
17、组、H2O2+Pue+anti-miR-NC 组和 H2O2+Pue+anti-miR-214 组。其中,Con 组以不含药物的正常培养基进行培养;H2O2组以 100 Mol/L 的 H2O2孵育 30 min(参考文献9);H2O2+Pue 组以10 Mol/L 葛根素预处理 24 h(参考文献10),再以 100 Mol/L 的 H2O2孵育 30 min;H2O2+Pue+anti-miR-NC 组 以10 Mol/L 葛根素预处理24 h,转染 inhibitors control后,再以100 Mol/L 的 H2O2孵育30 min;H2O2+Pue+anti-miR-214 组
18、以 10 Mol/L 葛根素预处理 24 h,转染 miR-214 inhibitors 后,再以 100 Mol/L 的H2O2孵育 30 min。具体转染步骤严格参照 Lipo-fectamineTM2000 转染试剂使用说明书进行操作。1.3 RT-qPCR 技术各组脊髓神经元细胞分组处理后,采用 TRIzol试剂分别提取总 RNA,使用超微量核酸蛋白检测仪测定 RNA 浓度及纯度,根据逆转录试剂盒将 RNA合成 cDNA,并以 cDNA 作为模板,以 U6 作为内参,采用实时荧光定量 PCR 检测试剂盒进行检测。引物:miR-214(上游 5-AGCCGACAGCAGGCACAGACA
19、-3,下游 5-TGGTGTCGTGGAGTCG-3);U6(上游 5-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3,下游 5-ATATGGAACGCTCACGAATTTG-3)。反应条件为:94预变性5 min;随后设40 个循环:94变性30 s、60退火 30 s、72延伸 30 s。待反应结束后,分析扩增曲线和熔链曲线,确定有无非特异性扩增,使用相对定量 2-Ct法分析各组脊髓神经元中 miR-214的相对表达量。1.4 CCK-8 检测脊髓神经元细胞接种到 96 孔板中,分组并给予相应处理后,除去各组细胞上清培养液,分别向每孔细胞中添加 10 L 的 CCK-8 试剂,继续孵育 2
20、 h,取出细胞培养板,使用酶标仪测定 490 nm 波长处细胞光密度(optical density,OD)值,分别计算细胞的活905颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.4性,即细胞活性(%)=(实验组 OD 值-空白对照组OD 值)/(对 照 组 OD 值-空 白 对 照 组 OD 值)100%。1.5 DCFH-DA 法检测脊髓神经元细胞分组处理后,用预冷的 PBS 洗涤,加入胰蛋白酶消化,离心去上清、收集各组细胞,加入 DCFH-DA 的 500 L 重悬细胞,
21、37 孵育30 min,离心去除 DCFH-DA,加入 PBS 洗涤细胞 3次,取适量的 PBS 重悬细胞,采用流式细胞仪检测荧光强度,发射波长为 525 nm,激发波长为 488 nm,以荧光强度反映细胞内 ROS 水平。1.6 试剂盒检测脊髓神经元细胞分组处理后,分别收集各组细胞的上清培养液,按照 SOD 活性检测试剂盒使用说明测定 SOD 的活性。1.7 ELISA 法检测脊髓神经元细胞分组处理后,分别收集各组细胞的上清培养液,按照 TNF-、IL-1 和 IL-6 ELISA检测试剂盒说明书,分别测定 TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量。1.8 流式细胞术脊髓神经元细胞分组处理后
22、,去除上清液,以胰酶消化,离心收集各组细胞,加入结合缓冲液重悬细胞,依次向细胞中分别加入 Annexin-FITC 和 PI 各5 L,轻轻混匀,室温避光孵育 15 min,立即上流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。1.9 Westernblot 检测脊髓神经元细胞分组处理后,向细胞中加入适量 RIPA 裂解液,冰上裂解提取总蛋白。采用 BCA法对蛋白进行定量测定。取等量蛋白样品行 SDS-PAGE 凝胶电泳,蛋白分离后,湿转至硝酸纤维素膜上,封闭液中封阻 2 h,加入 1:500 稀释的 Cleavedcaspase-3 单抗,于 4摇床过夜孵育,次日取出膜,滴加 1:3000 稀释的 HRP 标
23、记的二抗,室温孵育2 h,采用 ECL 化学发光,采集图像,以 GAPDH 进行标准化,采用 Image J 软件计算条带灰度值,计算各组细胞中 Cleaved caspase-3 的相对表达水平。1.10 统计学分析采用 SPSS 21.0 软件统计分析,计量资料以“xs”表示,多组间差异比较采用单因素方差分析,组间两两差异比较采用 SNK-q 检验,P0.05 代表差异有统计学意义。2 结果2.1各组脊髓神经元细胞中 miR-214 的表达量比较采用 RT-qPCR 技术检测脊髓神经元细胞中miR-214 的表达情况,结果发现(如表 1 所示),与Con 组相比,H2O2组细胞中 miR-
24、214 的表达量明显降低(P0.05);与 H2O2组相比,H2O2+Pue 组中miR-214 的表达量明显升高(P0.05);与 H2O2+Pue 组和 H2O2+Pue+anti-miR-NC 相比,H2O2+Pue+anti-miR-214 组中 miR-214 的表达量明显降低(P0.05)。表 1 各组脊髓神经元细胞中 miR-214 的表达量比较(xs,n=3)组别miR-214Con1.000.10H2O20.260.02H2O2+Pue0.940.09&H2O2+Pue+anti-miR-NC0.930.08H2O2+Pue+anti-miR-2140.350.03#$F82
25、.259P0.000 注:与 Con 组比,P0.05;与 H2O2组比,&P0.05;与 H2O2+Pue 组比,#P0.05;与 H2O2+Pue+anti-miR-NC 组比,$P0.052.2 各组脊髓神经元细胞活性比较采用 CCK-8 实验检测脊髓神经元细胞的活性,结果发现(如表 2 所示),与 Con 组相比,H2O2组细胞活性明显降低(P0.05);与 H2O2组相比,H2O2+Pue 组细胞活性明显升高(P0.05);与 H2O2+Pue组和 H2O2+Pue+anti-miR-NC 相比,H2O2+Pue+anti-miR-214 组细胞活性明显降低(P0.05)。表 2 各
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